Anaerober Schadstoffabbau

Präsentation zum Thema: "Anaerober Schadstoffabbau"—  Präsentation transkript:

1 Anaerober Schadstoffabbau

2 Organismus des Tages Azoarcus tolulyticus

3 Warum ist Azoarcus tolulyticus spannend?
Kann Toluol und Phenol abbauen Wurde aus einem kontaminierten Aquifer isoliert in Michigan Denitrifizierer sind praktisch alle fakultativ anaerob und können aerob atmen!

4 Phylogenie von Azoarcus tolulyticus
Domäne: Bakterien Phylum: Proteobacteria Klasse Betaproteobacteria Ordnung Rhodocyclales Familie Rhodocyclaceae Gattung Azoarcus

5 The uncultured majority
13 The uncultured majority 9 1205 4 n = published species 1367 220 8 Black: 12 original Phyla (Woese 1987) many pure cultures White: 14 new phyla since 1987 some isolates Gray: 26 candidate phyla no isolates 1808 91 What are they all doing ? 11 24 25 Rappé & Giovannoni (Annu Rev Microbiol, 2003) Keller & Zengler (Nat Rev Microbiol, 2004)

6 Facultative Anaerobes
Anaerobic bacteria using aromatics as sole source of energy and cell carbon Facultative Anaerobes Obligate Anaerobes Desulfococcus multivorans Geobacter metallireducens Thauera aromatica Azoarcus Synthrophobacterales g b d Rhodopseudomonas Magnetospirillum e a Proteobacteria Grampositive Desulfotomaculum Cyanobacteria Des weiteren haben wir uns mit dem Benzoatstoffwechsel des auch strikt anaeroben, Eisen reduzierenden G.m. befasst. Wie D.m. gehört er zu den d-Proteobakterien, die beiden Arten sind relativ nah miteinander verwandt. Man könnte also annehmen, dass sie ähnliche Strategien für den Benzoatstoffwechsel entwickelt haben könnten. Flavobacteria (Ferroglobus ?) Eukarya Archaea Green Sulfurbacteria Green Nonsulfurbacteria Thermotoga Aquifex

7

8 durch Mikroorganismen
Aromaten in der Natur Aminosäuren Rohöl, Kohle Lignin Abbau durch Mikroorganismen + O2 - O2 CO2 Flavonoide Phenole Tannine Lignane Quinone

9 Welche Schadstoffe sind wichtig?

10 Where has this picture been taken?

11 Wietze, Lüneburger Heide, around 1900

12 Natural oil seep in Wietze

13 Oil production 400 years ago

14 Oil sand production (1950) height 60 m, 1 Mill m3

15 Why study biodegradation activities in contaminated aquifers?
generic processes in the subsurface connecting function and structure of communities novel biochemistry O2, NO3-, SO42-, Fe(III)

16 Prinzipielle Probleme des anaeroben Abbaus von Kohlenwasserstoffen
Aktivierung – es fehlt der reaktive Sauerstoff Resonanzenergie des aromatischen Ringes Neue Chemie nötig

17 Funktionsweise der Benzylsuccinatsynthase, eine neues Radikalenzym

18 Benzylsuccinatsynthase gehört zu einer Familie von Radikalenzymen

19 Anaerobic catabolism of toluene
COO- O Benzyl- succinate C O S o A - C O S o A - C O - C H 3 Toluene Benzyl- succinyl-CoA E-Phenylita- conyl-CoA Succinyl-CoA 2[H] Fumarate Succinate H2O C O S C o A C O S C o A O C O O - H O C O O - C O S C o A Benzoyl-CoA Benzoyl- Succinyl-CoA 2-Carboxymethyl- 3-Hydroxy- Phenylpropionyl-CoA 1 2[H] Succinyl-CoA CoASH

20 Anaerobic catabolism of toluene
COO- O Benzyl- succinate C O S C o A C O S o A - C O - C O O - C H 3 Toluene Benzylsuccinate Synthase Benzylsuccinate- CoA Transferase Benzylsuccinyl-CoA Dehydrogenase Benzyl- succinyl-CoA E-Phenylita- conyl-CoA Phenylitaconyl- CoA Hydratase C O S C o A C O S C o A O C O O - H O C O O - C O S o Benzoyl-CoA A Benzoylsuccinyl CoA Thiolase 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase Benzoyl- Succinyl-CoA 2-Carboxymethyl- 3-Hydroxy- Phenylpropionyl-CoA 2

21

22 Construction of the multi-level well
Installation of a high resolution multi-level well in Düsseldorf-Flingern Construction of the multi-level well Kabel- und Kapillarstränge hochauflösendes Modul 4 Module vorgefertigt Bereit zur Abfahrt

23 Sulfate Isotope Analysis
Unsaturated zone Sulfate + Toluene Sulfide [mg l-1] δ18O / δ34S [‰] Saturated zone Depth [m bls] The plume fringe concept holds! Steep geochemical gradients at the fringes Biodegradation and sulfate reduction take place in the sulfidogenic zone of overlapping gradients of toluene and sulfate δ18O δ34S

24 Toluene Isotope Analysis
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 6 6,5 7 7,5 8 8,5 Depth [m bls] Toluene [mg l-1] -25,0 -24,5 -24,0 -23,5 -23,0 -22,5 -22,0 -21,5 -21,0 -20,5 δ 13C [‰] February 2006 -24.5 ‰ (6.9 m) -21.8 ‰ (7.1 m) Δ13C = -3.2 ‰  0.5 Toluene δ 13C Toluene Significant fractionation at plume fringes!

25 Quantitative distribution of bacterial 16S rRNA and bssA genes
▼GW table plume core sulfidogenic gradient zone lower contaminated zone deep zone 103 105 107 109 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0.0 0.5 1.0 1.5 Bacterial 16S rRNA genes [cp g-1] F1 cluster bssA genes [cp g-1] Ratio bssA/16S rRNA genes Depth [m] Highly specialized degrader community in sulfidogenic zone Distribution correlates to different zones Biomass does not reflect specific degraders [Winderl et al., in prep.]

26 Depth-resolved bacterial community shifts
Shannon index (H‘) B 1 2 3 4 T-RF length (bp) 5 150 300 450 600 750 900 * 6.3 m 6 Sulfidogenic zone: 130 137 149 159 177 228 bp T-RFs ▼GW table 6.65 m plume core 7 sulfidogenic gradient zone 130 149 159 228 * 6.8 m 177 8 130 7.2 m 159 lower contaminated zone 137 228 Depth [m] 9 * 7.6 m 10 8.7 m 11 9.8 m deep zone 12 * 11.7 m 13 * = cloned [Winderl et al., in prep.]

27 Ethylbenzol-abbau durch Denitrifizierer

28 Sulfatreduzierer und Ethylbenzol
Nutzen auch den Angriff durch Fumarat wie bei Toluol

29 Anaerober Phenolabbau

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31 Die anaerobe Ringöffnung

32 Frage! Wie würden Sie Crotonyl-CoA weiter abbauen?

33 Frage! Wie würden Sie Crotonyl-CoA weiter abbauen?
Antwort: Beta-Oxidation der Fettsäuren Hydratisierung zum Alkohol Dehydrogenase zum Keton Spaltung mit HS-CoA zu zwei Acetyl-CoA

34 Der Benzolring: Resonanzstabilisierung

35 Die Birch-Reduktion von Aromaten
Chemie: e-Donor: Na0 H-donor: X-OH . - - H+, e-, H+ e - 3 V H C S o A O A O C S o - . O S C o A Benzoyl-CoA Reduktase: e-Donor: Ferredoxin (ATP) H-donor: ? C e - H+, e-, H+ - 1.9 V H H

36 Benzoyl-CoA Reduktase aus Thauera aromatica
2 ATP + 2 H2O 2 Fd(red) 2 Fd(ox) 1 ATP / e- 2 ADP + 2 Pi Nitrogenase 16 ATP + 16 H2O 16 ADP + 16 Pi 2 ATP / e- N N 2 NH3 + H2 8 H+, 8 e-

37 Energetics of benzoate degradation
Denitrifyer: C7H6O2 + 6 HNO3  CO2 + 6 H2O + 3 N2 DG’° = ~ kJ mol-1 Sulfate Reducer: C7H6O2 + 4 H2O SO  7 HCO HS H+ DG’° = -203 kJ mol-1 Fermenting bacteria: 4 C7H5O H2O C2H3O2+ CO2 + 3 CH4 + 8 H+ DG’° = -48,5 kJ mol-1 Iron reducer: C7H6O H2O + 30 Fe(III)  7 HCO Fe(II) + 36 H+ DG’° = <-1000 kJ mol-1 Wie anfangs dargestellt, benötigt sowohl Aktivierung als auch Ringreduktion im Aromatenstoffwechsel von Denitryfizierern Energie in Form von ATP. Durch Verstoffwechselung von Benzoat zu CO2 können diese aber bis zu 3000kJ /mol Benzoat gewinnen, so dass diese energiereichen Initialschritte kein Problem aufweisen. Wegen ihrer anderen terminalen Elektronenacceptoren, leben Sulfatreduzierende Bakterien energetisch wesentlich ungünstiger. Es steht ihnen weniger als 1/10 der Energie von Denitrifizierern zur Verfügung. Es stellt sich somit die Frage, ob sich Sulfatreduzierer so energieverbrauchende Initialschritte wie wir sie bei Denitrifizierern finden, energetisch überhaupt leisten können.

38 Frage! Welche Aktivierungsreaktionen für Kohlenwasserstoffe haben sie bis jetzt gelernt? Welche Zentralen Metabolite? Welche Schlüsselreaktionen für den weiteren Abbau nach der Aktivierung?

39 Frage! Welche Aktivierungsreaktionen für Kohlenwasserstoffe haben sie bis jetzt gelernt? Fumarataddition radikalisch, direkte Oxidation, Phosphorylierung/Carboxylierung, Welche zentralen Metabolite? Benzoat Welche Schlüsselreaktionen für den weiteren Abbau nach der Aktivierung? Beta-Oxidation der Fettsäuren, Ringreduktion durch Benzoyl-CoA-Reduktase

40 Andere wichtige Substanzen
PAKs (Polycyclische Aromatische Kohlenwasserstoffe) Naphthaline (Abbauwege teilweise beschrieben) Phenanthren (nur ein Metabolit identifiziert, Carbonsäure) Biphenyl (nur ein Metabolit identifiziert, Carbonsäure) Benzol (Metabolite identifiziert, Benzoat, Phenol)

41 Why benzene and naphthalene?
Ecology: Very recalcitrant in nature Model system for PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbons) degradation Biochemistry: The most stable C-H bond known (480 kJ/mol) No such reaction known in chemistry or biology

42 Deltaproteobacteria Betaproteobacteria Clostridia Gammaproteobacteria

43 Substrate utilization of culture N47
20 40 60 80 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Sulfide [mM] Time [d] C O H Meckenstock et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66,

44 I. 2-Methylnaphthalene degradation
5 1 2 3 115 141 167 195 226 286 V C O H m/z Intensity 5 1 2 3 252 224 284 165 VI C O H m/z Intensity Annweiler et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66,

45 The naphthylmethylsuccinate synthase reaction
+ C O H Annweiler et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66,

46 Identification of the proteins involved in naphthalene- and 2-methylnaphthalene degradation
Mr (kDa) Naph 2MN 50 40 30 20 70 100 150 enzymes in naphthalene- and 2-metylnaphthalene-grown cells? comparison with the genome sequence of culture N47 Whole Genome Sequencing of culture N47 Genome size: 4,7 Mbp Bergmann et al., Environ. Microbiol. 2011

47 The nms genes from the genome
(nms= 2-naphthylmethyl succinate synthase) 1 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 bp nmsD nmsB nmsA nmsC (β-subunit) (α-subunit) (γ-subunit) NMS activating enzyme 2-Naphthylmethyl-succinate synthase (NMS) CH3 NmsABC COOH Fumarat COOH HOOC 2-Methylnaphthalene 2-Naphthylmethyl-succinate Selesi et al., J. Bacteriol. 2010

48 The bns genes from the genome (bns =
beta-oxidation of naphthyl-2-methyl succinate) 10,000 12,000 14,000 16,000 18,000 20,000 bp bnsH bnsG bnsF bnsE bnsD bnsC bnsB bnsA Naphthyl-2-hydroxymethyl-succinyl-CoA hydratase Naphthyl-2-methylen-succinyl-CoA dehydrogenase Naphthyl-2-methyl- succinate-CoA transferase Naphthyl-2-methyl-succinyl-CoA dehydrogenase Naphthyl-2-methyl-succinyl-CoA thiolase COSCoA COOH O COOH COSCoA COOH BnsEF BnsG BnsCD BnsH BnsAB COSCoA COOH OH COSCoA COOH COSCoA Selesi et al., J. Bacteriol. 2010

49 The upper 2-methylnaphthalene degradation pathway
C O - S oA H 3 2 * + 4 6 [ ] 7 5 8 1 u c i n a t ? o A 9 y l The upper 2-methylnaphthalene degradation pathway Succinyl-CoA Addition of fumarate β-Oxidation Central intermediate 2-naphthoic acid Analogy to toluene degradation

50 Putative degradation pathways
II. Naphthalene Putative degradation pathways C H 3 H O O C + C O O H 2 * 1 * C O O H C O O H 3 * [ C H ] 3 S u c c i n y l - C o A C O - S C o A ? S u c c i n a t C O O H 4 * 9 C O - S C A o 2 [ H ] C O O H 5 * C O 2 ? H O C O - S C o A 2 C O O H 6 O H C O O - C O - S C A o 1 * 2 [ H ] C O O H 7 O [ C o A ] H S - C A o S u c c i n y l - C o A 8 * C O - S C A o

51 Silver-stained 2-DGE gel of proteins from naphthalene- (left) and 2-methylnaphthalene-grown cells (right) Naph 2MN kDa 3 10NL pI 116 66 45 35 25 18 14 20 36 22 41 30 43 21 23 26 29 32 34 40 44 Bergmann et al., Arch. Microbiol. 2011

52 Carboxylase-ORFs corresponding to sequenced spots only expressed with naphthalene
Bergmann et al., Arch. Microbiol. 2011 Tab1 ORFs of N47 identified by MS/MS sequencing of selected overexpressed proteins of 2-DGE (figure 2). The up-regulation on naphthalene compared to 2-methylnaphthalene is given in the regulation factor column and the best enzyme match and corresponding function was retrieved from PEDANT database (Walter et al. 2009)

53 A novel enzyme reaction in (bio)chemistry
measuring naphthalene carboxylase activity  With ATP ® No ATP 13HCO-3 13COOH 2-naphthoic acid naphthalene Mouttaki et al., in review

54 Clear dependence on cell extract
Activity of naphthalene carboxylase determined within the first 10 min as a function of cell extract added.

55 Strong isotope exchange reaction of the carboxyl group
12C-2-naphthoic acid (closed symbols), 13C-2-naphthoic acid (open symbols) with () and without () addition of ATP. () indicates the control assay in the absence of cell extract.

56 proven degradation pathways
II. Naphthalene proven degradation pathways HOOC C H 3 + C O O H 2 * 1 * C O O H C O O H 3 * u c c i n y l - C o A C O - S C o A S u c c i n a t C O O H 4 * C O - S C A o 2 [ H ] C O O H 5 * C O 2 Activities measured in cell extracts H O C O - S C A o 2 C O O H 6 O H COOH C O - S C A o 2 [ H ] C O O H 7 O [ C o A ] H S - C A o S u c c i n y l - C o A ADP + Pi ATP 8 * C O - S o A C O - S C o A C O - S C o A + 2 [H] + 4 [H]

57 Does anaerobic naphthalene degradation occur in the field?
Investigation area ? Areas with NAPL-phase S2 wells N Groundwater flow 100 meter Contaminant source S1

58 Distribution of metabolites on a contaminated gas work site
[µg l-1] [µg l-1] naphthalene 2-methyl-naphthalene Griebler et al., Environ. Sci. Technol. 2004

59 Distribution of metabolites on a contaminated gas work site
2-methyl-naphthalene [µg l-1] Griebler et al., Environ. Sci. Technol. 2004

60 Distribution of metabolites on a contaminated gas work site
2-methyl-naphthalene [µg l-1] C O O H C O O H Griebler et al., Environ. Sci. Technol. 2004

61 Distribution of metabolites on a contaminated gas work site
2-methyl-naphthalene [µg l-1] C O O H Griebler et al., Environ. Sci. Technol. 2004

62 Distribution of metabolites on a contaminated gas work site
2-methyl-naphthalene [µg l-1] C O O H Griebler et al., Environ. Sci. Technol. 2004