Diagnostik von Pockenviren

Präsentation zum Thema: "Diagnostik von Pockenviren"—  Präsentation transkript:

1 Diagnostik von Pockenviren
Bund-Länder-AG „Szenarien bioterroristischer Anschläge und Abwehrmaßnahmen“ In dieser Präsentation wird dargestellt, wie die Diagnostik von Pockenviren bei einem Verdachtsfall in Deutschland erfolgen wird. Um den Begleittext zusammen mit den Folien auszudrucken, muss im Fenster „Drucken“ die Option „Notizseiten“ gewählt werden (Standardeinstellung ist „Folien“). Ausbildungsmaterial des Robert Koch-Instituts /01/2004 1

2 Gliederung Einleitung klinisches Bild
Eingruppierung des Erregers der Pocken Diagnostik und Differentialdiagnostik Elektronenmikroskopie Nachweis von Nukleinsäuren Erregeranzucht Probenahme und Versand Diagnostik aus Patientenmaterial und aus Umweltproben Liste der Laboratorien zur Pockendiagnostik Nach einer kurzen Einleitung über den Erreger, wird das klinische Bild der Pockenerkrankung dargestellt. Im Anschluss wird ein Überblick über die Eingruppierung, Klassifizierung und das Wirtsspektrum der Pockenviren gegeben. Im Hauptteil des Vortrags steht die Diagnostik von Pockenviren. Die elektronenmikroskopische Differenzierung, der Nachweis von Nukleinsäure mittels validierter molekularbiologischer Methoden, sowie die Erregeranzucht. Diagnostik und Bewertung werden unterschieden nach klinischen Proben und nach Umweltproben. Am Ende sind die Laboratorien aufgeführt, die eine Pockendiagnostik durchführen können. 2

3 Pocken Erreger: Variola-Virus
Inkubationszeit 12 bis 14 Tage ( Tage) Hohe Viruskonzentrationen in Vesikeln und Krusten Übertragung über Tröpfchen, hohe Viruskonzentration in Saliva Letalitätsrate ca. 30 % (Variola major) bzw. ca. 1 % (Variola minor) Die menschlichen Pocken werden durch das Variola Virus hervorgerufen. Es gibt zwei Varianten des Virus: Variola major und Variola minor, die sich im klinischen Erscheinungsbild unterscheiden und unterschiedliche Letalitäten aufweisen. Bei Variola major versterben etwa 30 %, bei der milderen Form, der Variola minor, etwa 1 % der Erkrankten. Der Mensch ist der einzige natürliche Wirt. Inkubationszeit: Die Inkubationszeit von der Ansteckung bis zum Ausbruch der Krankheit beträgt im Durchschnitt 12 bis 14 Tage, insgesamt kann der Zeitraum zwischen 7 und 19 Tagen liegen. Der Infizierte ist in dieser Zeit noch nicht ansteckend. Dauer der Ansteckungsfähigkeit: Die Kontagiosität beginnt mit oder unmittelbar vor dem plötzlich einsetzenden hohen Fieber, Kopf- und Rückenschmerzen. Dies sind die Zeichen des Initialstadiums, in dem der Patient über Tröpfchen aus dem Rachen hochkontagiös ist. Eine Ansteckungsmöglichkeit besteht ebenfalls über die Effloreszenzen, die sich wenige Tage später bilden. Die Ansteckungsgefahr besteht bis zur Abheilung der letzten Effloreszenzen (einschließlich der Schleimhäute). Eine indirekte Übertragung insbesondere durch kontaminierte Wäsche und Kleidung des Kranken, durch benutzte Gegenstände sowie durch Inhalation von pockenvirushaltigem (in der Regel krustenhaltigem) Staub ist möglich. In Aerosolform ist das Virus abhängig von Temperatur und Luftfeuchtigkeit maximal 24 Stunden lebensfähig, in der Kruste über Wochen und Jahre. 3

4 Pocken als Biowaffe 1754/67 Briten „schenkten“ Indianern in Nordamerika Pockenvirus-verseuchte Decken > 50% der Mitglieder der betroffenen Stämme starben Nach einer großangelegten Ausrottungskampagne der Weltgesundheits-organisation (WHO) ereignete sich der letzte bekannte, natürliche Fall 1977 in Somalia. Seitdem traten die einzigen bekannten Fälle bei einem durch einen Laborunfall verursachten Ausbruch im Jahr 1978 in Birmingham in England auf, bei dem eine Person starb. Die Pocken wurden 1980 von der WHO offiziell für ausgerottet erklärt. Im Dezember 1979 wurde ein Abkommen geschlossen, das beinhaltete, alle verbliebenen Bestände des Virus zu zerstören oder in eines der beiden Sicherheitslaboratorien zu verbringen - eines in den Vereinigten Staaten und eines in der damaligen Sowjetunion. Dieser Prozess wurde in den frühen 80er Jahren abgeschlossen, seitdem hatte offiziell kein anderes Labor Zugang zu Pockenviren. Auch wenn es als eher unwahrscheinlich eingestuft wird, lässt sich nicht völlig ausschließen, dass Pockenviren an anderen Orten außer den genannten Laboren existieren und vorsätzlich freigesetzt werden, um gezielt Schäden zu verursachen. Im 18. Jahrhundert wurden Pocken bereits von den Briten als "Biowaffen" eingesetzt. Sie „verschenkten“ mit Pockenviren verseuchte Decken an die Indianer. Dies führte zu einer verheerenden Ausbreitung unter den "nicht immunen" Ureinwohnern Amerikas, da diese Infektionskrankheit wie auch Masern und Tuberkulose auf eine ungeschützte Population trafen. 4

5 Pocken - klinisches Bild
Tag Tag 5 Tag 7 Die Bilder veranschaulichen das Auftreten von Krankheitssymptomen bei einem Kleinkind. Der Ausschlag beginnt mit kleinen roten Punkten (Enanthem) auf Zunge und Rachen, die Person ist zu diesem Zeitpunkt sehr ansteckend. Der folgende Hautausschlag beginnt im Gesicht und verbreitet sich, meist innerhalb von 24 h, über Arme und Beine bis zu Händen und Füssen. Etwa am dritten Tag bilden sich Papeln, die sich ab dem vierten Tag mit virushaltiger Flüssigkeit füllen. Die Papeln werden zu Pusteln, die nach etwa 5 Tagen verkrusten / verschorfen. Nach weiteren 5 Tagen, also etwa 14 Tage nach Auftreten des ersten Ausschlags sind alle Pusteln verschorft. Etwa 3 Wochen nach Beginn des Ausschlags ist aller Schorf abgefallen, erst danach, ist die Person nicht mehr ansteckend. Zu beachten ist die dichtere Verteilung der Läsionen auf dem Gesicht und an den Armen. Pocken treten im Gegensatz zu Windpocken auch auf den Handflächen und den Fußsohlen auf. Eine weitere Unterscheidungsmöglichkeit zu Windpocken im klinischen Bild ist, dass sich alle Pusteln bei den menschlichen Pocken im selben Entwicklungsstadium befinden, während sie bei Windpocken in den verschiedenen Stadien gleichzeitig vorkommen. Das Fieber tritt bei Pocken etwa Tage vor dem Ausschlag auf, bei Windpocken sind ansteigendes Fieber und das Auftreten des Ausschlags normalerweise gleichzeitig zu beobachten. 5

6 Klassifizierung von Chondropockenviren
(Pockenviren der Vertebraten) Orthopoxviren Variola, Vaccinia, Affenpocken, Kuhpocken, Kamelpocken Avipoxviren Geflügelpocken, Kanarienpocken Capripoxviren Ziegenpocken, Schafspocken, Lumpy Skin Disease Leporipoxvirus Myxomatose Parapoxvirus Orf, Pseudokuhpocken Suipoxvirus Schweinepocken Molluscipoxvirus Molluscum contagiosum Yatapoxvirus Tanapocken, Yabapocken Variola gehört zu den Orthopockenviren, die wiederum zu den Chondropockenviren, den Pockenviren der Vertebraten zugeordnet werden. Zu den Chondropockenviren gehören weitere Pockenviren des Geflügels, der Ziegen und Schafe, das Myxomatosevirus der Kaninchen und der Erreger des Molluscum contagiosum des Menschen. Diese Viren lassen sich auf Grund des Wirtsspektrums, der Pathogenese, der Morphologie und Morphogenese (Elektronenmikroskopie) und des Genomaufbaus unterscheiden. 6

7 Orthopockenviren Virus Infektionen bei Wirtsbereich Variola Mensch eng
Vaccinia Büffel, Kuh, Mensch, Schwein, breit Kaninchen, natürlicher Wirt? Affenpocken Menschenaffen, Affen, Mensch breit natürlicher Wirt: Eichhörnchen (?) Kuhpocken Karnivoren, Kuh, Mensch, Ratte breit natürlicher Wirt: Gerbils, Nagetiere (?) Kamelpocken Kamel eng Ectromelia Mäuse, natürlicher Wirt (Wühlmäuse?) eng Waschbärpocken Waschbär (racoon) breit? Wühlmauspocken Wühlmäuse (vole) eng Uasin-Gisha-Pocken Pferd, natürlicher Wirt? mittel Taterapocken Tatera kempi (Gerbilart) eng Bei einigen Orthopockenviren ist das Wirtsspektrum sehr eng, z. B. beim Variola-Virus, dessen einziger natürlicher Wirt der Mensch ist. Andere Vertreter hingegen wie z. B. Vaccinia, welches als Impfvirus bei der Pockenschutzimpfung verwendet wird, Affenpocken und Kuhpocken weisen ein breites Wirtsspektrum einschließlich des Menschen auf. 7

8 Übersicht über die Laboruntersuchungen
Elektronenmikroskopie orientierende Schnelldiagnostik (ca. 30 min.) Unterscheidung zwischen Herpesviren, Para- und Orthopockenviren Nachweis von Nukleinsäuren/Sequenzierung Unterscheidung zwischen verschiedenen Orthopockenviren (innerhalb von 24 h) Virusanzucht Nachweis der Vermehrungfähigkeit (Asservierung für weitergehende Untersuchungen) EM zur Schnelldiagnostik von Pocken- und Herpesviren: Zur orientierenden Schnelldiagnostik von Pocken- und Herpesviren (z.B. bei Windpocken (Varizellen) beim Erwachsenen verursacht durch das Varizella-Zoster-Herpesvirus: die Windpocken sind hier klinisch nur schwer von den Pocken zu unterscheiden) wird die Elektronenmikroskopie eingesetzt. Bei einem klinischen Pockenverdacht kann hier auf Grund der großen Virusmengen in den Hautläsionen schnell, 15 min nach Probeneingang im EM-Labor zwischen Herpesviren, Ortho- und Para-Pockenviren unterschieden werden. Die Vertreter der Orthopockenviren lassen sich morphologisch nicht voneinander differenzieren. Der EM-Befund: “Orthopockenviren (OPV)” ist damit für sich allein nicht ausreichend und bedarf der Differenzierung (z.B. Variola versus Vaccinia) durch molekularbiologische Methoden (PCR, Stammbaumanalyse) (ausführliche Beschreibung der Arbeitsschritte und Abbildungen der Viren s. folgende Folien) Nachweis von Nukleinsäure (PCR): Mit der PCR können Patientenproben oder Umweltproben untersucht werden. Verschiedene PCR-Nachweissysteme sind beschrieben, die verschiedene Gene der OPV als Zielsequenz verwenden, d. h. es wird eine sogenannte Consensus-PCR (Nachweis aller Vertreter der Orthopoxviridae) verwendet. Bei einem positiven Resultat erfolgt die Differenzierung des Variola-Virus von den anderen OPV z.B. über Sequenzierung (ausführliche Beschreibung der Arbeitsschritte s. Folie 14). Mit einer gesicherten Antwort ist, falls keine unvorhergesehenen technischen Probleme auftreten, innerhalb von 24 Stunden zu rechnen. Virusanzucht (nur in BSL4-Laboratorien) Die Anzucht von Pockenviren kann nur aus nativen, nicht-inaktivierten Patientenmaterialien bzw. aus nativen Umweltproben erfolgen. Sie ist nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4 möglich (zur Zeit in Deutschland nur Marburg bzw. Hamburg). Eine Identifizierung des Virus erfolgt nach Präparation der Virus-DNA aus den Zellen über PCR mit Sequenzierung. Die Anzucht von Viren ist zur Bestätigung einer klinischen Probe nicht notwendig, sollte aber dennoch angestrebt werden, um die Probe zu asservieren, bzw. für die weitere (forensische) Untersuchung an weitere Labors in Deutschland oder an die CDC in den USA zu versenden. Bei einer Umweltprobe ist sie zum Nachweis der Vermehrungsfähigkeit erforderlich. 8

9 von Pockenviren und Herpesviren
EM-Differenzierung von Pockenviren und Herpesviren Zur Differenzierung von Pockenviren wird für die orientierende Diagnostik bevorzugt das Elektronenmikroskop (negative staining Methode, Transmissionsmikroskop) eingesetzt. Damit kann bei einer Verdachtsdiagnose Pocken z. B. in Material, das von Läsionen gewonnen wurde, zwischen Herpesviren (Vesikelbildung durch Varizella Zoster Virus), Orthopockenviren und Parapockenviren unterschieden werden. Herpesviren sind umhüllt und enthalten ein ikosaedrisches Kapsid. Orthopockenviren sind quaderförmig, auf der Oberfläche sind unregelmäßige Strukturen zu erkennen. Parapocken, Erreger des Orf und des Melkerknotens, sind oval und die Oberflächenstrukturen sind regelmäßig angeordnet (bandförmig). Die Methodik wird in Deutschland qualitätskontrolliert in etwa 20 EM-Laboratorien vorgehalten. Sie ist technisch einfach und führt in 15 min zu einer orientierenden Diagnose. Proben für die EM: geeignet sind Vesikel-Inhalt und Krusten. Die Hautläsionen enthalten jeweils hinreichend grosse Mengen an morphologisch detektierbarem Virus. Es muss auf sterile Umverpackung geachtet werden: der Beipack-Zettel sollte auch informieren, wie die Proben fixiert / inaktiviert worden sind und an wen der EM-Befund zu übermitteln ist. Herpesvirus Orthopockenvirus Parapockenvirus Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom 9

10 EM-Differenzierung Verschiedene Aspekte der Orthopockenviren (OPV)
Zeigt die EM in der negativ-kontrastierten Probe „Orthopockenviren (OPV)“, so muss diese orientierende Morpho-Diagnose weiter abgeklärt werden, da sich die Vertreter der Orthopockenviren morphologisch nicht voneinander differenzieren lassen. Neben dem Variolavirus können auch andere OPV vorliegen, wie das Vaccinia-Impfvirus, Affen-, Kamel- und Mäusepockenviren. Zur Klärung helfen Krankheits-Umstände und Anamnese sowie die vertiefte Labordiagnostik durch molekularbiologische Methoden (PCR, Stammbaumanalyse). Diese wird auf einer späteren Folie ausführlich dargestellt. OPV: mit Virushülle OPV: M-Form OPV: M-Form+C-Form Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom 10

11 Elektronenmikroskopie
Fixierung des Probenmaterials (z.B. mit 4 % Formaldehyd in 0,05 M HEPES-Puffer pH 7,0 oder PBS) Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens (z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium-Hypochlorid oder 2 % Peressigsäure) Negativkontrastierung (stabile, stark adhäsive Trägernetze; als Kontrastmittel parallel Phosphorwolframsäure und Uranylazetat oder Ammoniummolybdat) Probenvorbereitung (bei klinischen Proben sollte dies bereits nach der Probenahme vor dem Versand durch den Probenehmer geschehen, siehe folgende Folie, bei Umweltproben evtl. erst im Labor) Eine sichtbare Menge an Probenmaterial wird in ein fest zu verschließendes Probenröhrchen (z. B. ein Einfrierröhrchen mit Außengewinde und V-förmigem Boden) gegeben, in dem je nach Menge des zu unter-suchenden Materials 0,2–0,5 ml gepuffertes Fixans, z. B. 4 % Formaldehyd in 0.05 M HEPES-Puffer pH 7,0 oder PBS vorgelegt wurden. Nach Verschließen des Röhrchens wird dessen gesamte Innenfläche durch Schütteln mit dem Fixans benetzt und für mindestens 30 Min. bei RT inkubiert. Die Außen-Desinfektion der Röhrchen wird mit 10 % Formaldehyd 15 Min. oder 2,5 % Na-Hypochlorid 10 Min. oder 2 % Peressigsäure 15 Min. bzw. mit einem auf der RKI-Liste genannten Desinfektionsmittel zur Flächendekontamination in einem Tauchbad durchgeführt. Das Probenröhrchen sollte schwimmend in einem zweiten, mit Fixans gefüllten Außenröhrchen an das EM-Labor gegeben werden. (Entsprechend behandelte Proben können als nicht infektiöses Untersuchungsmaterial an die von der DVV registrierten EM-Untersuchungslaboratorien oder direkt an das Konsiliarlabor versandt werden.) Elektronenmikroskopie Die EM ermöglicht eine schnelle Differentialdiagnose und klärt, ob überhaupt Viren der Ortho-pockenvirus- (OPV-) Gruppe vorliegen (Nachweisgrenze ca. 105 Viruspartikel pro ml). Als morphologische Kriterien der OPV gelten Größe und Form sowie die OPV-charakteristischen Oberflächenmuster (bis zu 50 nm lange “Filamente” oder “Gyri” von 10–20 nm Breite) oder die “dreifach-gewendelte” Innenstruktur. Eine morphologische Differenzierung von OPV in Variola-, Vaccinia-, Affen- oder Mäusepockenvirus u.a. ist über die EM nicht möglich. Typ-spezifische Antikörper für die schnelle Immun-EM sind nur z.T. in den USA und in Russland vorhanden. Die EM erfolgt als Schnelldiagnostik nach Negativkontrastierung der adsorbierten Probe. Verwendet werden sollten stabile (400 mesh), stark adhäsive (z.B. durch Beglimmung oder 1% Alcian-Blau behandelte) Trägernetze (grids). Als Kontrastmittel sollte parallel zur Phosphorwolframsäure (PTA, 1–2 %, pH 7,0–7,2) auch Uranylazetat (Uac) oder Ammoniummolybdat eingesetzt werden. Längere Einwirkzeiten bei den adsorbierten Proben mit PTA pH 8.0 oder höher können zur Darstellung der Innen-Wendel führen, während Uac und Ammoniummolybdat die OPV-Oberflächenstruktur besser erkennen lassen (weitere Details zur Methodik können beim Konsiliarlaboratorium für elektronenmikroskopische Erregerdiagnostik abgefragt werden, Adresse s. letzte Folie der Präsentation). Die hier angegeben Zeiten und Konzentrationen beziehen sich nur auf Pockenviren, liegt bei Umweltproben der Verdacht auf eine zusätzliche Kontamination mit anderen Erregern vor, müssen teilweise längere Inkubationszeiten eingehalten werden. 11

12 Elektronenmikroskopie Aufarbeitung von Proben für den Versand
1 Versand von Vesikelflüssigkeit Probenahme durch den verantwortlichen Arzt (1, 2) Pockenbläschen mit Schere, Pinzette o.ä. öffnen (1) bzw. Schorf mit Pinzette entnehmen (2) Vesikelprobe auf Objektträger, direkt oder mit Tuberkulin-spritze (1) Lufttrocknen (1, 2) Inaktivierung (1, 2) bruchsicherer Container (1, 2) Sterile Umverpackung (1, 2) 2 Versand von Vesikeln / Schorf Die Entnahme von klinischen Proben für die Diagnostik wird vom verantwortlichen Arzt vorgenommen, spätestens jedoch vom Amtsarzt. Entnahme für die Elektronenmikroskopie: Versand von Vesikelflüssigkeit (Foto 1) Bewährt ist der Versand von Vesikelflüssigkeit nach Eintrocknen auf einen Glasobjektträger. Ein häufig mehrkammeriges Pockenbläschen wird mit Schere, Pinzette o.ä. Besteck geöffnet und ein Glasobjektträger vorsichtig mittig auf die freie Flüssigkeit abgedrückt. Alternativ kann Blasenflüssigkeit auch mit Hilfe einer Tuberkulinspritze gewonnen und auf den Objektträger gebracht werden. Die Präparate werden nach gründlicher Lufttrocknung durch Eintauchen für 5 sec in 4% Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer inaktiviert. Der Versand erfolgt im flachen Objektträger-Behälter. Versand von Vesikelproben / Pustel-Schorf (Foto 2) Versand von Vesikelproben: Präparate ! nach gründlichem Lufttrocknen und Inaktivierung (Eintauchen in 4% Formaldehyd für 5 sec) im flachen Container (s. o.) oder als Objektträger-“Sandwich“ (Streichhölzer, Büroklammern o.ä. als Distanzhalter) im Plastik-Röhrchen. Versand von Pustel-Schorf: Präparate ! nach Inaktivierung (s. o.) im kleinen Plastik-Röhrchen Allgemeine Hinweise: Ein erfahrenes, “zuständiges” EM-Labor sollte vorab bekannt sein. Geeignete, qualitätsgesicherte EM-Laboratorien sind bei der DVV gelistet. Eine Zusammenstellung findet sich ebenfalls auf der letzten Folie dieser Präsentation. In kritischen Fällen kann auf die EM-Laboratorien am RKI und in den Kompetenzzentren in Frankfurt, Hamburg und München zurückgegriffen werden. Proben für die EM: geeignet sind Vesikel-Inhalt und Krusten (Die Hautläsionen enthalten jeweils hinreichend große Mengen an morphologisch detektierbarem Virus). Außendesinfektion des Objektträger-Behälters / Containers (s. vorherige Folie) Auf sterile Umverpackung muss unbedingt geachtet werden: der Beipack-Zettel sollte informieren, wie die Proben fixiert / inaktiviert worden sind und an wen der EM-Befund zu übermitteln ist. Quelle Fotos: RKI Quelle: RKI 12

13 Elektronenmikroskopie Aufarbeitung von Proben für den Versand - Grid-Methode
EM-Trägernetz mit dunklen „Ober“- Seite für 2-3 sec auf die Bläschenflüssigkeit abdrücken, pro Läsion 2-3 Grids Lufttrocknen in der Pinzette Inaktivierung mit 4% Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer Versand: - beschriftetes Röhrchen - sterile Umverpackung Grid-Methode Eine sehr viel höhere Ausbeute ermöglicht die sehr effektive „direkte Grid-Methode“, sie setzt jedoch eine enge Zusammenarbeit zwischen Klinik und EM-Labor voraus. Das EM-Trägernetz wird mit seiner dunklen „Ober“- Seite für 2-3 sec auf die Bläschenflüssigkeit abgedrückt. Zu beachten: am Vesikelboden sind die größten Virusmengen. Nach Lufttrocknen in der Pinzette wird das Grid mit 4% Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer inaktiviert und nach Umverpackung in das EM-Labor transportiert. Pro Läsion 2-3 Grids im beschrifteten Röhrchen einsenden. Quelle Fotos: RKI 13

14 Nachweis von Nukleinsäuren
Inaktivierung des Probenmaterials (z.B. mit Lysispuffer % Guanidiniumchlorid) Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens (z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium-Hypochlorid oder 2 % Peressigsäure) Probenaufbereitung/Isolierung der DNA (Protease, AL-Puffer) Nachweis von Nukleinsäuren Consensus PCR (Vertreter der Orthopoxviridae OPV) Differenzierung des Variola-Virus von anderen OPV (Sequenzierung z. B. crmB-Gen, ATI-Gen, HA-Gen oder validierte Varila-spezifische PCR ) Aufbrechen und Inaktivieren infektiöser Agenzien (Viren) für die PCR / Versand: Vor dem Versand müssen die Proben inaktiviert werden, am besten geeignet ist dafür folgendes aufgeführtes Schema, sollte dies nicht möglich sein, ist auch eine Inaktivierung durch Autoklavieren möglich, hierdurch kann jedoch die Sensitivität der nachfolgenden Untersuchungen herabgesetzt werden. Anschließend können die Proben in einer auslaufsicheren Umverpackung an das informierte Labor gesendet werden. Am Beispiel der Aufarbeitung unter Verwendung des Lysispuffers AL aus dem QIAamp Blood Kit von Qiagen soll ein Vorschlag für die Inaktivierung gemacht werden. Andere DNA-Aufreinigungen wie z.B. mit dem Puregene Kit der Fa. Gentra (vertrieben über Biozym) sind ebenso möglich. Der Lysispuffer AL enthält 25–50 % Guanidiniumchlorid. Dies ist ein chaotropes Salz, das Viren und Zellen sofort durch Desintegration inaktiviert. Ein Aliquot des Untersuchungsmaterials(Umweltprobe) wird in einer Glove-Box in Reaktionsröhrchen überführt und der Lysispuffer dort zugegeben. Nach 10-minütiger Einwirkungszeit kann das Probenröhrchen von außen dekontaminiert werden (s. Folie 11; ggf. kann die Inkubation der Probe bereits im Tauchbad erfolgen, um die Untersuchungszeit zu verkürzen) und zur weiteren Untersuchung aus der Glove-Box (im BSL3-Labor) ausgeschleust werden. Entsprechend behandelte Proben können als nicht infektiöses Untersuchungsmaterial versandt werden. Probenaufarbeitung: 200 μl Vol. (Blut, Plasma/Serum, Zellkultursuspension), hier: Materialsuspension in PBS oder Wasser Zugabe von : 25 μl Protease, μl AL Puffer (vorgewärmt auf 70°C) Mischen durch Vortexen, Inkubation 10 Min. bei 70°C. Danach sind Viren oder vegetative Bakterienzellen vollständig inaktiviert. Die Lyse durch AL-Puffer wird durch den Proteaseverdau unterstützt und führt nach Literaturangaben zu einem sensitiveren Nachweis der DNA als Präparationen ohne Protease (z. B. bei HBV). Für weitere Informationen s. Sicherheitsdatenblatt Qiagen bzw. Nachweis von Nukleinsäure (PCR) Mit der PCR können Patientenproben oder Umweltproben untersucht werden. Der Aufschluss und die Inaktivierung von Umwelt- oder Patientenproben kann nach obigem Schema erfolgen. Verschiedene PCR-Nachweissysteme sind beschrieben, die verschiedene Gene der OPV als Zielsequenz verwenden, d. h. es wird eine sogenannte Consensus-PCR (Nachweis aller Vertreter der Orthopoxviridae) verwendet. Bei einem positiven Resultat erfolgt die Differenzierung des Variola-Virus von den anderen OPV über Sequenzierung bzw. über RFLP (Hämagglutinin-Gen [Ropp et al., 1995]; crmB-Gen [Loparev et al., 2001]; ATI-Gen [Meyer et al., 1997]). Die Aufreinigung der DNA und die PCR nehmen ca. 8 h in Anspruch. Falls keine EM-Diagnostik durchgeführt wird oder in der EM ein unklarer Befund vorliegt, sollte bei Proben, die von Patienten mit Verdacht auf Pocken stammen, parallel eine VZV-PCR für die Differentialdiagnose Windpocken mitgeführt werden. Wichtig ist, eine Inhibitionskontrolle bzw. Amplifikationskontrolle mitzuführen, z.B. mit Vaccinia-Virus-DNA. Hier können z. B. parallele Ansätze mit definierten Mengen an DNA-Fragmenten gespeikt werden. 14

15 Erregeranzucht Nur aus nicht-inaktiviertem Probenmaterial
Nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4 (BSL4) Eine Differenzierung erfolgt nach Präparation der Virus-DNA über PCR mit Sequenzierung und phylogenetischer Analyse Virusanzucht Die Anzucht von Pockenviren kann nur aus nicht-inaktivierten Patientenmaterialien bzw. Umweltproben erfolgen (aus asserviertem, nativem Material) und ist nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4 möglich (zur Zeit in Deutschland nur Marburg und Hamburg). Eine Identifizierung des Virus erfolgt nach Präparation der Virus-DNA aus den Zellen über PCR mit Sequenzierung. 15

16 Gewinnung klinischer Proben
Zusammenfassung der Möglichkeiten zur Probenahme: EM: 1) getrockneter Abstrich auf Objektträger, fixiert mit 4 % FA 2) Spritze: Spritzen-Inhalt in Röhrchen mit wenig 4% FA 3) Spritze: Übertragung in ein Röhrchen, fixiert mit 4 % FA 4) Direkter Abklatsch (Grid) fixiert mit 4 % Formaldehyd PCR: Aliquot in Reaktionsröhrchen (in einer Glove-Box) Benötigtes Material zur Probenahme: Schutzausrüstung Pinzette, Schere, Spritze, Objektträger, Grid (je nach Technik) Versandröhrchen (z.B. Einfrierröhrchen) Stoßsichere, auslaufsichere Umverpackung (mit Beipackzettel) Zur Fixierung/Desinfektion : 4 % Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer (EM) Lysispuffer AL, Puregene Kit, o. ä. (PCR) Desinfektionsmittel zur Außendekontamination Eine Zusammenfassung der soeben aufgeführten Möglichkeiten zur Probennahme für die Elektronenmikroskopie: 1) getrockneter Abstrich auf Objektträger, fixiert mit 4 % Formaldehyd 2) Spritze: Spritzen-Inhalt in Röhrchen mit wenig 4% Formaldehyd 3) Spritze: Übertragung in ein Röhrchen, fixiert mit 4 % Formaldehyd 4) Direkter Abklatsch fixiert mit 4 % Formaldehyd Für die PCR wird ein Aliquot des Untersuchungsmaterials in einer Glove-Box in Reaktionsröhrchen überführt und der Lysispuffer dort zugegeben. Das benötigte Material (s.o.) hängt auch von der Art der Probenahme ab. Als Desinfektionsmittel zur Außendekontamination sind z.B. geeignet: 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium-Hypochlorid oder 2 % Peressigsäure 16

17 Gewinnung von Umweltproben (1)
Probenahme durch Einsatzkräfte (z.B. Feuerwehr) Sicherstellung, dass kein explosiver Stoff / kein chemischer Kampfstoff enthalten ist Risikoanalyse: Fall 1: geschlossenes Behältnis Fall 2: geöffnetes Behältnis (a) Feststoff, (b) Pulver, (c) Flüssigkeit Fall 3: Freisetzung Schutzkleidung anlegen Probenahme Außendesinfektion des Probenahmegefäßes Stoßfeste Umverpackung Beschriftung der Umverpackung (Fundort, Datum, Uhrzeit) Vor Durchführung einer mikrobiologischen Diagnostik ist sicher zu stellen, dass es sich nicht um Explosivstoffe oder chemische Kampfstoffe handelt. Prinzipiell sollte ein differenziertes Vorgehen angestrebt werden. Als erstes muss eine Risikoanalyse durchgeführt werden: (1) Handelt es sich um ein geschlossenes Behältnis (Umschlag, Päckchen, etc.) (2) Falls das Behältnis (Umschlag, Päckchen, etc.) geöffnet wurde: ist der Inhalt (a) Papier, bzw. solides Trägermaterial (b) ein Pulver (c) eine Flüssigkeit (3) Ist Material entnommen worden oder konnte der Inhalt ausfließen oder verschüttet werden; wurden Aerosole frei Im Fall 1 ist das Risiko einer Exposition mit Krankheitserregern gering. Der Gegenstand sollte in folgender Weise asserviert werden: Anlegen von Schutzkittel/ Einmaloverall und doppelten Einweghandschuhen (Einsatzkräfte), eventuel Mund-, Nasen-und Augenschutz anlegen. Verbringen des Gegenstandes in einen reißfesten Plastikbeutel (gegebenenfalls Frischhaltebeutel, Müllbeutel oder Vergleichbares) geeigneter Größe. Ausziehen des äußeren Handschuhpaares (das richtige Ausziehen von Handschuhen sollte geübt werden) und Entsorgung in den Plastikbeutel (s. oben). Einbringen des ersten Beutels in eine geeignete, möglichst stoßfeste Umverpackung (gegebenenfalls auch zweiter Plastikbeutel). Die Umverpackung ist in geeigneter Weise zu verschließen. Beschriftung der Umverpackung mit Angaben zu Fundort, Datum und Uhrzeit. Entsorgung des zweiten Handschuhpaares. und des Schutzkittels/Overalls in einen Plastiksack. Transport des asservierten Materials und des Plastiksacks mit abgelegten Handschuhen und Schutzkittel/Overall zu einem Untersuchungslabor (genaue Angaben zum Transport sind in Kapitel Probentransport aufgeführt). Fall 2a: Das Behältnis (Brief/Päckchen, etc.) enthielt nur Papiere, Zellstoff oder festes Material: In Ergänzung zum Vorgehen wie unter Fall 1 Fall 2b und 2c: Das Behältnis enthielt ein Pulver, freie Flüssigkeit etc.: Anlegen eines Einwegschutzanzuges (Einsatzkräfte). Anschließend ist analog wie unter 1 beschrieben vorzugehen. Nach Asservierung der Proben sollte der Raum in dem das Behältnis gefunden wurde bis zur Klärung der Situation verschlossen werden. Zur Dekontamination von Oberflächen wird 1% Peressigsäure (“frisch” angesetzt) oder 10% Formalin (37% Formalinkonzentrat ca. 1 : 4 verdünnt mit Wasser) verwendet. Einwirkzeit der Peressigsäure soll mindestens 30 Minuten, des Formalin 2 Stunden betragen (Anthraxsporen). Anschließend werden Handschuhe, Mundschutz und Einwegschutzanzug durch Verbrennung entsorgt. Fall 3: Weitergehende Schutzmaßnahmen sind notwendig, wenn Räume oder Bereiche betreten werden müssen, in denen Stäube oder Aerosole entstehen konnten und verbreitet wurden. Hier sind organisatorisch verschiedene Bereiche einzurichten: Schwarzbereich, Graubereich, Weißbereich (s. nächste Folie). 17

18 Gewinnung von Umweltproben (2)
Schwarzbereich: durch Probe kontaminierter Bereich Schutzanzug mit positivem Druck Raum verschließen Desinfektion der Oberflächen (Entscheidung, ob und wann ) Graubereich: Übergangsbereich (Schleuse) Außendesinfektion des Probenahmegefäßes weitere Verpackung des Probenmaterials Desinfektion der Schutzanzüge etc. Weißbereich: nicht-kontaminierter Bereich Betreten nur nach Desinfektion der Schutzkleidung Nur steril verpackte Probe Schwarzbereich: Der Bereich, der durch die verdächtige Probe kontaminiert worden sein kann. Graubereich: Übergangsbereich (Schleuse), in diesen Bereich wird kontaminiertes Material (Probe, Schutzanzüge, etc.) gebracht, um sicher verpackt und desinfiziert zu werden Weißbereich: nicht-kontaminierter Bereich Der Schwarzbereich darf nur mit Schutzanzug mit positivem Druck betreten werden. Die Probennahme muss geeignet sein, erregerhaltiges Material zu sammeln (z.B. Wischproben oder geeignete Luftproben). Die Asservierung sollte analog wie unter Fall 1 beschrieben erfolgen. Der Raum/Bereich muss so lange verschlossen/abgesperrt bleiben, bis nach Identifikation der Substanz/Erreger über geeignete Desinfektionsmaßnahmen entschieden werden kann. Es ist Sorge zu tragen, dass aus diesem Bereich kein weiteres unbeabsichtigtes Verbreiten der Substanz/Erreger möglich ist (z.B. durch Abschaltung der Klimaanlage, Verschließen von Fenstern und Türen). Vor Ort und im Einzelfall ist zu entscheiden, ob nach Probennahme eine sofortige Desinfektion der Oberflächen durchgeführt werden muss. Im Graubereich sollte eine weitere Verpackung des Probenmaterials durch zusätzliches Personal erfolgen. Im Graubereich sollten geschulte Mitarbeiter in Einwegschutzanzügen mit Mundschutz und Einweghandschuhen den Schutzanzug am Mann nach Einsatz mit Desinfektionsmittel (Peressigsäure, Formalin) abwaschen und nach Handschuhwechsel den Mitarbeiter, der unter dem Chemikalienschutzanzug einen Einwegoverall trägt, entkleiden. Alle Schutzanzüge und andere potenziell kontaminierte Gegenstände müssen in entsprechenden Verpackungen zur Desinfektion mit Gasen (Ethylenoxid, Formalin), Sattdampf oder zum Verbrennen gebracht werden. Achtung! Abspritzen (z.B. “Kärchern”) kann zum Versprühen von infektiösen Erregern führen. Liegt der Verdacht auf eine zusätzliche Kontamination mit weiteren Erregern als dem Pockenvirus vor, müssen die Sicherheitsvorschriften für diese Erreger zusätzlich beachtet werden (z.B. bei bekannten Resistenzen des Erregers gegen einige Desinfektionsmittel, bei erhöhter Resistenz durch Sporenbildung, etc.) Nach Desinfektion der Schutzkleidung kann der nicht-kontaminierte Weißbereich betreten werden. Je nach Situation kann es möglich sein, dass Umweltproben nicht vor Ort inaktiviert werden können, sondern im nicht inaktivierten Zustand unter den entsprechenden Sicherheitshinweisen- und versandbedingungen (s. folgende Folie) an die informierten Laboratorien gesendet werden müssen. In diesem Fall muss die Inaktivierung sofort bei Entgegennahme der Probe im entsprechenden Labor durchgeführt werden. Bei einer Umweltprobe, bei der es sich um einen begründeten Verdacht auf Pockenviren handelt, muss diese an eines der beiden L4 Laboratorien gesendet werden. Eine nicht inaktivierte Probe muss konserviert werden, da nur durch eine Anzucht ein Verdacht bestätigt werden kann (s. Folien 20 und 23). 18

19 Probentransport Schnellstmöglicher Probentransport zum Labor (Wenn anderweitig nicht sichergestellt, muss der Transport per Polizeistreife oder Hubschrauber erfolgen.) Information des Ansprechpartners im Labor Verpackung der Probe laut Sicherheitsbestimmungen und Anforderungen an die Diagnostik Lückenloses Probennahme- und Transportprotokoll (inklusive Personen, Probenzustand und Zeiten) Persönliche Übergabe durch vorab bestimmten Kurier (Übergabeprotokoll wird momentan erstellt) Sofortige Bestätigung des Probeneingangs durch das Labor an den behandelnden Arzt oder zuständigen Amtsarzt Ein reibungsloser Probentransport muss gesichert werden, um eine schnelle labordiagnostische Klärung zu gewährleisten und gleichzeitig eine Gefährdung durch unsachgemäß verpacktes Probenmaterial zu verhindern. Wenn anderweitig nicht sichergestellt, muss der Transport per Polizeistreife oder Hubschrauber erfolgen. Es muss sichergestellt sein, dass die Proben vorschriftsmäßig verpackt wurden, um eine Kontamination der Umgebung während des Transports auszuschließen (Schulung der Ärzte und des Transportpersonals). Information des Ansprechpartners im Labor durch den behandelnden Arzt/Amtsarzt (Liste mit Untersuchungslabors (mit definierter maximaler Transportzeit) und Ansprechpartnern (mit regelmäßiger Aktualisierung)) Verpackung der Probe laut Sicherheitsbestimmungen und Anforderungen an die Diagnostik Lückenloses Probennahme- und Transportprotokoll (inklusive Personen, Probenzustand und Zeiten) Probe muss persönlich durch vorab bestimmten Kurier überbracht werden, Übergabeprotokoll wird momentan erstellt Ausreichende Kapazität für schnellen Transport sicherstellen (z.B. Vereinbarung mit Polizei etc.) Sofortige Bestätigung des Probeneingangs durch das Labor an den behandelnden Arzt/Amtsarzt Verpackungsmaterial: Vorhaltung des Verpackungs- und Entnahmematerials möglichst vor Ort (aber mindestens so, dass dieses innerhalb von 2 Stunden vor Ort zur Verfügung steht, am geeignetsten über die Gesundheitsämter) Ausführliche Ausführungen zu Transport und Verpackung sowie die Bedingungen unter denen ein Transport von infektiösem Material möglich ist, sind auf der homepage des RKI abrufbar unter: unter dem Punkt „Anhang“ findet sich: Probenversand Regelungen über den Postversand von medizinischem und biologischem Untersuchungsgut (PDF-Datei, 47 KB) Liste von Firmen, die Verpackung für Versand von infektiösem Material anbieten und Beschreibung der Verpackung (PDF-Datei, 15 KB) Aktuelle Einschränkungen der Post, wodurch auf private Kurierdienste verwiesen wird: 19

20 Pockenvirusdiagnostik
Klinische Probe Umweltprobe Probenasservierung z.B. Rachenabstrich; Blut; z.B. Pulver, Erdprobe, Vesikelinhalt; Krusten 1. Fixierung für EM Wasser, Abklatsch etc. 2. Inaktivierung für PCR 3. Asservierung für Anzucht Untersuchung im EM PCR Anzucht in Zellkultur Negativkontrastierung Orthopocken- und Differenzierung mit PCR (Differentialdiagnose zu VZV) Variola-spezifische Sequenzierung Orthopockenviren Primer bzw. Sonden positiv beide positiv beide positiv Klinische Probe: Verdacht Klinische Probe: bestätigt Aufgezeigt ist ein Flussdiagramm, wie eine Diagnostik aus Patientenmaterial bzw. aus einer Umweltprobe durchgeführt werden soll. Prinzipiell sollen drei Proben in geeigneten Plastikröhrchen wie z. B. Einfrierröhrchen gewonnen werden. Für die Untersuchung im Elektronenmikroskop werden Formaldehyd (Glutaraldehyd) fixierte Proben eingesetzt, für den Genomnachweis muss das Material mit denaturierendem Puffer (käuflicher Puffer zur Isolierung von Nukleinsäuren für molekulargenetische Untersuchungen) inaktiviert werden. Diese beiden Proben können dann nach Desinfektion der Oberflächen unter üblichen Laborbedingungen, bevorzugt L2/BSL2 weiter bearbeitet werden. Insbesondere für die Bewertung von Umweltproben muss eine native Probe asserviert werden (Einfrierröhrchen) aus der gegebenenfalls infektiöses Virus nachgewiesen werden kann, wenn sich der Verdacht auf das Vorliegen von Orthopocken/Variolavirus aus den Untersuchungen mit EM und PCR ergibt. Die Anzucht von Pockenviren in Zellkultur darf nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4 durchgeführt werden. Die Anzucht von Viren ist zur Bestätigung einer klinischen Probe nicht notwendig, sollte aber dennoch angestrebt werden, um die Probe zu asservieren, bzw. für die weitere (forensische) Untersuchung an weitere Labors in Deutschland oder an die CDC in den USA zu versenden. Die Bewertungskriterien dieser Diagnostik sind auf den folgenden Folien unterschieden nach klinischen Proben und nach „Umwelt“proben ausführlicher dargestellt. Umweltprobe: Verdacht Umweltprobe: begründeter Verdacht Umweltprobe: bestätigt Vorbereitung von drei Probengefäßen: Die Schritte 1–3 werden bei klinischen Proben direkt bei der Abnahme von Patienten und bei „Umweltproben“ in einer Glove Box durchgeführt. Eine Anzucht von Pockenerregern ist nur in BSL-4-Laboratorien möglich. Nach Fixierung bzw. nach Inaktivierung können die Proben unter BSL-1/-2-Bedingungen weiter bearbeitet werden . 20

21 Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in klinischem Material (1)
Verdacht auf Pockenviruserkrankung: Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus klinischer Probe Pockenviren sind nach Richtlinie 2000/54/EG in die Risikogruppe 4 eingestuft. Bei der Diagnostik von Proben mit Pockenverdacht handelt es sich um nicht gezielte Tätigkeiten nach Biostoffverordnung. Diagnostische Erstuntersuchungen mittels PCR oder Elektronenmikroskopie können nach Biostoffverordnung in Verbindung mit der TRBA 100 “Schutzmaßnahmen für gezielte und nicht gezielte Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen in Laboratorien” (BArbBl. 4/02 S. 122–127) der Schutzstufe 3 zugeordnet werden. Die TRBA 100 enthält hierzu in Abschnitt folgende Aussage: “(4) Liegen Verdachtsmomente einer Infektion mit einem biologischen Arbeitsstoff der Risikogruppe 4 vor, sind alle Untersuchungen mit nicht inaktiviertem Material in der höchst möglichen zur Verfügung stehenden Schutzstufe, mindestens jedoch unter Bedingungen der Schutzstufe 3 durchzuführen.” Laboratorien, in denen orientierende Erstdiagnostik durchgeführt wird, müssen mindestens den Anforderungen der Schutzstufe 3 nach Anhang II Biostoffverordnung entsprechen und alle dort benannten Sicherheitsmaßnahmen erfüllen. Die entsprechenden Regelungen der TRBA 100 sind zu berücksichtigen. Eine Liste der entsprechenden Labors ist auf der letzten Folie dieser Präsentation angegeben. Aus klinischem Material (Tupfer oder Abklatschpräparaten, die mit Formaldehyd fixiert sind) können elektronenmikroskopisch Orthopockenviren nachgewiesen werden. 21

22 Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in klinischem Material (2)
Bestätigt positiv: Positive Orthopockenvirus-/Variola-PCR aus klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (validierte PCR, Sequenzierung) oder Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung) (Anzucht von Pockenviren aus klinischem Material und Bestätigung von Variola mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung)) Der Nachweis, dass es sich um Variola handelt, kann nur molekulargenetisch durch validierte PCR und Sequenzierung mit anschließender phylogenetischer Analyse erfolgen. Hierzu wird klinisches Material mit geeigneten denaturierenden Puffern inaktiviert und die virale DNA für die molekularen Analysen eingesetzt. Tätigkeiten zur weiterführenden Diagnostik bei positivem Orientierungsbefund sind der Schutzstufe 4 zuzuordnen. Laboratorien, in denen diese Tätigkeiten durchgeführt werden, müssen den Anforderungen der Schutzstufe 4 nach Anhang II Biostoffverordnung entsprechen und alle dort benannten Sicherheitsmaßnahmen erfüllen. Im Rahmen der diagnostischen Orientierungsuntersuchung positiv befundene Proben sind zur Bestätigung des Befundes unverzüglich an ein Laboratorium der Schutzstufe 4 abzugeben (Adressen s. vorletzte Folie dieser Präsentation). Der Versand der Proben erfolgt unter den erforderlichen Sicherheitsbestimmungen. Die Anzucht von Viren ist zur Bestätigung einer klinischen Probe nicht notwendig, sollte aber dennoch angestrebt werden, um die Probe zu asservieren, bzw. für die weitere (forensische) Untersuchung an weitere Labors in Deutschland oder an die CDC in den USA zu versenden. 22

23 Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in “Umwelt”proben
Verdacht: Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus einer Umweltprobe begründeter Verdacht: PCR positiv für Orthopockenviren bzw. für Variola; Differenzierung der Viren mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung, Stammbaumanalyse) Bestätigung: Anzucht von Pockenviren zum Nachweis der Vermehrungs- fähigkeit in Zellkultur und Bestätigung von angezüchtetem Variolavirus mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung, Stammbaumanalyse) Ein elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus einer Umweltprobe gibt einen Verdacht auf pockenhaltiges Material. Eine positive Polymerasekettenreaktion (PCR) für Orthopockenviren bzw. für Variola zur Differenzierung der Viren mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung) führt bei einer Umweltprobe zu einem begründeten Verdacht. Eine Bestätigung dieses Verdachts erfolgt, wenn zusätzlich zur positiven PCR die Anzucht eines Pockenvirus zum Nachweis der Vermehrungsfähigkeit in Zellkulturpositiv verlaufen ist. Diese Anzucht darf nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4 durchgeführt werden (z.Z. nur in Hamburg und Marburg). 23

24 Vorschlag für Laboratorien
zur Pockendiagnostik Aufgeführt sind Laboratorien, die in der Lage sind, eine orientierende Diagnostik für Pockenviren durchzuführen. Angegeben sind nach Rücksprache mit den Fachgesellschaften solche Laboratorien, die sowohl die elektronenmikroskopische als auch die molekulargenetische Untersuchung durchführen können. Nur in den beiden Laboratorien in Marburg und in Hamburg können auch Anzuchtversuche durchgeführt werden (L4/BSL4- Laboratorien). Die Anzucht ist besonders im Falle von Umweltproben wichtig, da die Infektiosität des Virus nachgewiesen werden muss. 24

25 Diagnostische EM-Laboratorien mit überprüfter Expertise*
* Expertise geprüft von der DVV 25