Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen.

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1 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen

2 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Tag 4 Auswertung von Bindungsexperimenten Aufgabe 9: Bindungsgleichgewichte Aufgabe 10: Identische, unabhängige Bindungsstellen Aufgabe 11+12: Unabhängige Bindungsstellen Aufgabe 13: Kooperative Bindung Aufgabe 14: Auswertung von Bindungsdaten nach verschiedenen Modellen

3 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Binäre Bindungsgleichgewichten Modell nach ausmultiplizieren und umstellen: mit c i =c A,ges -c AB erhält man:

4 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Auswertung von binären Bindungsgleichgewichten pq x² + px + q = 0 Es kann nur - gelten Warum?

5 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Binäre Bindungsgleichgewichte Modell: Ziel: Signal = BL + f AB c AB

6 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Auswertung von binären Bindungsgleichgewichten Modell: Lösung: c A, ges [nM]1,00E+00 Null4,30E-03 F(AB)1,01E+00 K Ass [M]9,87E+07 0 c B,ges [nM]Signal, expc AB,theo [nM]Signal,theoFQ 00 0,00 0 1,00E-011,01E-02 0,01 0 2,00E-011,94E-02 0,02 0 5,00E-014,69E-02 0,040,050 1,00E+009,18E-02 0,080,090 2,00E+001,69E-01 0,150,160 5,00E+003,31E-01 0,32 0 1,00E+014,89E-01 0,480,490 2,00E+016,54E-01 0,660,670 5,00E+018,49E-01 0,830,840 1,00E+029,20E-01 0,910,920 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 050100 cB [nM] Signal Signal, exp Signal,theo

7 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Mehrere, identische Bindungsstellen Beispiel: Modell: A + nB AB n k1k1 k -1 Protein bindet unspezifisch an DNA Jedes Molekül A hat n Bindungsstellen. Effektive Konzentration der Bindungsstellen für B ist n×c A.

8 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Mehrere, identische Bindungsstellen Modell: A + nB AB n k1k1 k -1 Modell : A + B AB

9 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Grenzen von Modellen und Schlussfolgerungen Alle Bäume haben Stämme! Alle Bäume haben Blätter!

10 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Grenzen von Modellen und Schlussfolgerungen Niedrige Konzentration der konstanten Komponente (A) A A AA +B AB A A B B B B B BB A +B AB A B B B B B BB B B B B B A +B AB A B B B B B BB B B B B B B B B B wenn c A <<c B dann gilt c B c B,ges Relative Sättigung ist unabhängig von c A. Stöchiometrie kann nicht bestimmt werden Wir brauchen großen Überschuß von B um A zu sättigen. Stöchiometrie kann nicht bestimmt werden.

11 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente c A <<1/K Ass 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 01000200030004000 c B /c A Signal Kurvenform definiert K Ass K Ass kann genau bestimmt werden n ist nicht definiert Niedrige Konzentration der konstanten Komponente (A) Grenzen von Modellen und Schlußfolgerungen

12 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Hohe Konzentration der konstanten Komponente (A) A A AA +B AB A A +B AB +B AB B B B B Stöchiometrische Titration A, B und AB koexistieren nicht K Ass kann nicht bestimmt werden Grenzen von Modellen und Schlußfolgerungen

13 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Grenzen von Modellen und Schlussfolgerungen c A >>K Ass 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 02468 c B /c A Signal K Ass kann nicht bestimmt werden n ist sehr genau messbar Stoichiometrie bei Sättigung definiert n Hohe Konzentration der konstanten Komponente (A)

14 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Verschiedene Modelle vergleichen Das Modell definiert die Beziehungen zwischen den Meßgrößen und den Variablen des Experiments, z.B. der Konzentration eines Komplexes AB in Abhängigkeit von der Zeit, sowie der Konzentrationen von A und B: c AB = f(t, c A, c B ) Ein Modell ist immer als Arbeitshypothese zu betrachten, die angezweifelt werden muß, wenn keine gute Anpassung der Daten möglich ist. Will man ein Modell durch ein komplizierteres ersetzen, ist genau zu überprüfen, ob die Daten dies rechtfertigen.

15 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Gültigkeitskriterien für Modelle Absolutbetrag der Abweichungen: Liegt die theoretische Kurve im Bereich der experimentellen Unsicherheiten jedes einzelnen Messpunktes? könnte OK sein kann nicht sein !

16 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Gültigkeitskriterien für Modelle Verteilung der Abweichungen: zufällig oder systematisch ( Runs test) könnte OK sein eher unwahrscheinlich

17 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Gültigkeitskriterien für Modelle Gibt es ein Alternativmodell und können die Daten damit besser angepaßt werden? besseres Modell Modell wechseln kein besseres Modell altes Modell weiterverwenden

18 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Gültigkeitskriterien für Modelle Absolutbetrag der Abweichungen: Liegt die theoretische Kurve im Bereich der experimentellen Unsicherheiten jedes einzelnen Messpunkts? Verteilung der Abweichungen: zufällig oder systematisch? Gibt es ein Alternativmodell und können die Daten damit besser angepasst werden? Ein gutes Modell sollte auch Daten erklären können, die bei der Formulierung des Modells noch nicht bekannt waren.

19 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Das Prinzip der Sparsamkeit Daten sollen mit möglichst wenig Variablen beschrieben werden. Achtung: Jede kompliziertere Variante eines Modell, das die Daten beschreibt, beschreibt die Daten auch! Experimentell kann ein ungeeignetes Modell widerlegt, aber nie die Gültigkeit eines geeigneten Modells bewiesen werden. Insbesondere ist es schwierig zu erkennen, daß ein zu kompliziertes Modell gewählt wurde.

20 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Auswertung von Bindungsgleichgewichten Modell: A + B AB mit: c A << c B, d.h. c B c B,ges. ) ergibt sich: c AB = K Ass ×c B,ges. ×c A,ges. - K Ass ×c B,ges. ×c AB c AB (1+ K Ass ×c B,ges. ) = K Ass ×c B,ges. ×c A,ges. Relative Besetzung der Bindungsstelle (c AB /c A,ges. ) ist unabhängig von c A,ges. Stöchiometrie der Bindung kann nicht gemessen werden

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22 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente 2 Bindungsstellen Modell: K 1 =K 4, K 2 =K 3 unabhängige Bindungsstellen K 1 <<K 3, K 2 <<K 4 kooperative Bindung A AB AB 2 +B -B +B -B

23 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Unabhängige Bindungsstellen Modell: A AB AB 2... AB n +B -B +B -B +B -B +B -B d.h. man misst die c B,geb in Abhängigkeit von c A,ges

24 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Unabhängige Bindungsstellen Fall 1: Detektion von B gebunden (K Ass,1 >> K Ass,2 ) c B,ges. 1 + 2 2 1 2 B,ges. c 1 + 2 1 Abweichung der Kurvenform deutet auf 2 Bindungsstellen nur detektierbar, wenn sich K Ass,1 und K Ass,2 deutlich unterscheiden

25 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Unabhängige Bindungsstellen 0 0,5 1 c B,ges. 1 = 2 1 2 0 0,5 1 c B,ges. verzögerte Besetzung von AB 2 leicht sigmoidale Kurvenform Fall 2: Detektion von AB 2 (K Ass,1 K Ass,2 ) 1 = 2 1 2

26 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Kooperative Bindung (Hill Modell) Modell: A + nB AB n Vorraussetzung : c A << c B, d.h. c B c B,ges. mit: K Ass = K i n

27 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Kooperative Bindung (Hill Modell) c B,ges. stark sigmoidale Kurvenform verzögerte Besetzung bei kleinen c B,ges. steilerer Anstieg der Kurve bei mittleren c B,ges.

28 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Mehrzähniger Ligand, lineares Makromolekül N: Anzahl Elementarbindungsplätze des Makromoleküls (hier ca. 100) L: Anzahl Elementarbindungsplätze benötigt pro Ligand (hier 14) Lücke groß genug für weiteren Liganden Lücke zu klein für weiteren Liganden L N Scheinbare Sättigung tritt zu früh ein !

29 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Tag 4 Auswertung von Bindungsexperimenten Aufgabe 9: Bindungsgleichgewichte Aufgabe 10: Identische, unabhängige Bindungsstellen Aufgabe 11+12: Unabhängige Bindungsstellen Aufgabe 13: Kooperative Bindung Aufgabe 14: Auswertung von Bindungsdaten nach verschiedenen Modellen