Master-Seminar Benjamin Hanf

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1 Master-Seminar Benjamin Hanf 13.06.2012
Phosphatidylserin-Exposition an der Membran roter Blutzellen als Apoptose-Marker und Aggregationsparameter Master-Seminar Benjamin Hanf

2 Grundlagen: PS PS: Phosphatidylserin Vorlesung I. Bernhardt Biophysik Lipid-Übersicht

3 Grundlagen: Aufrechterhaltung der Asymmetrischen Lipid-Verteilung im Bilayer
10x 1x Modell Bilayer (Modifiziert nach Zwaal et al., 2005)

4 Aussortieren alter Blutzellen in der Milz
(Hämoglobin) Retikulozyt (RNA / DNA Reste) Phagozytose Max. 120 Tage 4 Lebenszyklus RBCs (Modifiziert nach Silbernagel und Despoupolos et al., 2004)

5 PS: Bedeutung bei Thrombusbildung
Thrombusbildung altes Modell (modifiziert nach )

6 Thrombusbildung neues Modell
Thrombusbildung (Modifiziert nach B. Nguyen 2010)

7 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 PGE2, LPA Ca2+ Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert H2O, K+, Cl- Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

8 PS-Exposition mit LPA, A23187 und PMA
PS-Exposition von RBCs mit LPA, A23187 und PMA (Bach Nguyen 2010)

9 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 PGE2, LPA Ca2+ Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert H2O, K+, Cl- Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

10 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert H2O, K+, Cl- Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

11 Modell PMA: Einfluss von Ca2+ auf die PS-Exposition
PS-Exposition von RBCs mit PMA +/- Ca2+ (Bach Nguyen 2010)

12 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 PGE2, LPA Ca2+ Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert Bei PMA ist Ca2+ Einstrom nicht alleine verantwortlich, bei LPA/A23 spielt Gardos-Kanal mit eine Rolle. H2O, K+, Cl- Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

13 Einfluss von PKC auf die PS-Exposition
PKC inhibiert Aaminophospholipid Translocasen  erhöhter PS-Exposure Inhibierung der PKC und Einfluss auf die PS-Exposition von RBCs (Bach Nguyen 2010)

14 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 LPA Ca2+ PKC Scramblase PS  PS induziert H2O, K+, Cl- Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

15 Einfluss von Gardos-Kanal auf die PS-Exposition
Mögliche Erklärung: K+ efflux wird durch Ca2+ influx kompensiert, dadurch muss aber Ca2+ Pumpe mehr arbeiten, mehr ATP wird verbraucht, nach 24h spät. ATP verbraucht und Ca2+ Peak ist zu hoch. Dadurch Induktion der Scramblase. Links: Immitierter Gardos-Kanal mittels Valinomycin (Ionophor, K+-Transport) Rechts: Blockierung des Gardos-Kanals (Bach Nguyen 2010)

16 Entwicklung des Modells der PS-Exposition
A23187 A23187 Ca2+ Ca2+ PKC Scramblase PS  PS induziert H2O, K+, Cl- Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

17 Einfluss von Gardos-Kanal auf die PS-Exposition
Stimulierung der RBC mit A23187 und Inhibierung des Gardos-Kanals mit Charybdoxin (Bach Nguyen 2010)

18 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 PGE2, LPA Ca2+ Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert Bei PMA ist Ca2+ Einstrom nicht alleine verantwortlich, bei LPA/A23 spielt Gardos-Kanal mit eine Rolle. H2O, K+, Cl- Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

19 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 PGE2, LPA Ca2+ mOsm Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert Bei PMA ist Ca2+ Einstrom nicht alleine verantwortlich, bei LPA/A23 spielt Gardos-Kanal mit eine Rolle. H2O, K+, Cl- Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

20 Einfluss von osmotischen Druck auf die PS-Exposition
Schwarz: Ohne Ca2+ Weiß: Mit Ca2+ Physiologische Lösung bei 305 Einfluss von osmotischen Druck auf die PS-Exposition (Bach Nguyen 2010)

21 Einfluss von osmotischen Druck auf die PS-Exposition
Schwarz: Ohne Ca2+ Weiß: Mit Ca2+ Physiologische Lösung bei 305 Einfluss von osmotischen Druck auf die PS-Exposition (Bach Nguyen 2010)

22 Einfluss von Vorhandensein von ATP auf die PS-Exposition
Einfluss von ATP auf die PS-Exposition (Bach Nguyen 2010)

23 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 PGE2, LPA Ca2+ mOsm Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert Flippase H2O, K+, Cl- X*ATP PS  PS Ca2+ Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

24 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 PGE2, LPA Ca2+ mOsm Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert Flippase Caspasen Caspasen sind eine Gruppe von Proteasen mit einem Cystein im aktiven Zentrum (Cysteinproteasen). Sie spalten Peptidbindungen C-Terminal von Aspartat. Daher der Name: Caspase (Englisch cysteinyl-aspartate specific protease). Caspasen sind die wichtigsten Enzyme der Apoptose, dem programmierten Zelltod. H2O, K+, Cl- Oxidativer Stress X*ATP PS  PS Ca2+ Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

25 Einfluss von Caspasen und oxidativem Stress auf die PS-Exposition
Aktivierung der Caspasen durch ZnCl2, Oxidativer Stress durch tert-Butyl-Perhydroxid (Bach Nguyen 2010)

26 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Entwicklung des Modells der PS-Exposition Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ A23187 PGE2, LPA Ca2+ mOsm Ca2+ PKC aktiviert Scramblase PS  PS PMA induziert Flippase Caspasen Caspasen sind eine Gruppe von Proteasen mit einem Cystein im aktiven Zentrum (Cysteinproteasen). Sie spalten Peptidbindungen C-Terminal von Aspartat. Daher der Name: Caspase (Englisch cysteinyl-aspartate specific protease). Caspasen sind die wichtigsten Enzyme der Apoptose, dem programmierten Zelltod. H2O, K+, Cl- Oxidativer Stress X*ATP PS  PS Ca2+ Gardos-Kanal H2O, K+, Cl- Signalkaskade von RBCs (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

27 Relevanz von intrazellulärem Ca2+ auf die PS-Exposition
Weiß: Fluo-4 (Ca2+) + Annexin V (PS) Gelb: Nur Fluo-4 (Bach Nguyen 2010) Beispiel einer Zelladhäsion bei RBCs induziert durch LPA (Steffen 2011)

28 Adhärentes Verhalten von RBCs mit A23187, LPA und PMA
PS---Ca2+---PS Rezeptor CD36 Adhäsion von RBCs durch Phosphatidylserin (Bach Nguyen 2010, Yamaja Setti et al., 2002)

29 Adhäsion von RBCs mit Ca2+ und Rezeptor CD36
fluorescence activated cell sorting Ca CD36 FACS-Messung von Adhäsion von RBCs mit Ca2+ und Rezeptor CD36, mitte: Negativkontrolle (Yamaja Setti et al., 2002)

30 Modell zur Adhäsion von RBCs mit Ca2+ und Rezeptor CD36
Adhäsion von RBCs mit Ca2+ und Rezeptor CD36, blaue Punkte: PS, rosa Y: CD36 (Bach Nguyen 2010)

31 Bsp. An Krankheiten: Fehler in PS-Exposition
- Scott-Syndrom (Bluterkrankheit) Antiphospholipid-Syndrom (erhöhtes Risiko zu Thrombosen) Sichelzellanämie (erhöhte PS-Exposition  Risiko zu Thrombosen) Nierensteine (Bindung von Ca2+ auf Nierenzellen) - Malaria (erhöhter oxidativer Stress sowie Ca2+ -Aufnahme  Risiko zu Thrombosen)

32 Scott-Syndrom (Bluterkrankheit)
PGE2, LPA PS PS PS PS Scramblase PS  PS (seltene Bluterkrankheit, Ca2+- induzierter Mechanismus, durch den PS auf die Membranaußenseite transportiert wird, defekt) PS PS RBC (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

33 Antiphospholipid-Syndrom (erhöhtes Risiko für Thrombose)
PS PS PS PS PS (binden an die mit Phospholipid - assoziierte Proteine, führt häufig zu Thrombosen) mit Phospholipid - assoziiertes Protein Antiphospholipid 33 RBC (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

34 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Sichelzellanämie (erhöhtes Risiko für Thrombose) Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ Ca2+ Ca2+ Scramblase PS  PS Ca2+ Translocase (Fehler im Hämoglobin resultiert in Formänderung (Sichelzellen), Subpopulation mancher Zellen erhöhte PS Exposition da Amoniphospholipid-Translocase ohne Funktion ist, oder kurzzeitig aktivierte Scramblase durch erhöhten Ca2+-Einstrom) PS  PS RBC (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

35 Nierenzelle (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)
Nierensteine Oxalat-Kristall PS PS PS PS (PS-Exposition auf Nierenzellen führen zu Bindung von Calcium-Oxalat-Kristallen auf Oberfläche) Nierenzelle (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

36 (2-wertige Kationen; Ca2+)
Malaria (erhöhtes Risiko für Thrombose) Kationen-Kanal (2-wertige Kationen; Ca2+) Ca2+ Scramblase PS  PS PS  PS (parasitäre Erkrankung, die hohen oxidativen Stress sowie erhöhte Calcium-Aufnahme verursacht) Oxidativer Stress RBC (Modifiziert nach Kaestner et al., 2004)

37 Zusammenfassung Modell der PS-Exposition von RBCs Signalmolekülen (Gardos-Kanal, Ca2+) oxidativer Stress osmotischer Druck Einfluss von Caspasen Modell zur Adhäsion von PS PS---Ca2+---PS Rezeptor CD36 Krankheiten bei fehlerhafter PS-Exposition 5 Beispiele

38 Referenzen Zwaal, R.F., Schroit, A.J., “Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells” (1997) Blood, 1997, 89: Mandal, D., Moitra, P.K., Saha, S., Basu, J., “Caspase 3 regulates phosphatidylserine externalization and phagocytosis of oxidatively stressed erythrocytes” (2002) FEBS Lett, 2002, 513: Kucherenko, Y.V., Weiss, E., Bernhardt, I., “Effect of the ionic strength and prostaglandin E2 on the free Ca2+ concentration and the Ca2+ influx in human red blood cells” (2004) Bioelectrochemistry, 2004, 62: Andrews, D.A., Low, P.S., “Role of red blood cells in thrombosis” (1999) Curr Opin Hematol, 1999, 6: Weiss, H.J., Lages, B., “Platelet prothrombinase activity and intracellular calcium responses in patients with storage pool deficiency, glycoprotein IIb-IIIa deficiency, or impaired platelet coagulant activity a comparison with Scott syndrome” (1997) Blood, 1997, 89: Wu, Y., Tibrewal, N., Birge, R.B., “Phosphatidylserine recognition by phagocytes: a view to a kill” Trends Cell Biol, 2006, 16: Verhoven, B., Schlegel, R.A., Williamson, P., “Mechanisms of phosphatidylserine exposure, a phagocyte recognition signal on apoptotic T lymphocytes” (1995) J Exp Med, 1995, 182: Uchida, K., “Induction of apoptosis by phosphatidylserine” (1998) J Biochem, 1998, 123: Schlegel, R.A., Williamson, P., “Phosphatidylserine, a death knell. Cell Death Differ” (2001) 2001, 8: Ravichandran, K.S., Lorenz, U., “Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol” (2007) 7: Kuypers, F.A., De Jong, K., “The role of phosphatidylserine in recognition and removal of erythrocytes” (2004) Cell Mol Biol, 2004, 50: Quan, G.B., Han, Y., Yang, C., Hu, W.B., Liu, M.X., Liu, A., Wang, Y., Wang, J.X., “Mechanism of erythrocyte phosphatidylserine exposure induced by high concentrated glucose” Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, (2008) 16: Kiedaisch, V., Akel, A., Niemoeller, O.M., Wieder, T., Lang, F., „Zinc-induced suicidal erythrocyte death” (2008) Am J Clin Nutr, 2008, 87: Sutton, D.J., Tchounwou, P.B., “Mercury-induced externalization of phosphatidylserine and caspase 3 activation in human liver carcinoma (HepG2) cells” (2006) Int J Environ Res Public Health, 2006, 3: Telen, M.J., “Red blood cell surface adhesion molecules: their possible roles in normal human physiology and disease” (2000) Semin Hematol, 2000, 37: 117. Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M.R., “Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium” (1999) Br J Haematol, 1999, 107:

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