Aktuelle Aspekte der Zöliakie

Präsentation zum Thema: "Aktuelle Aspekte der Zöliakie"—  Präsentation transkript:

1 Aktuelle Aspekte der Zöliakie
Aktuelle Aspekte der Zöliakie Herbert Wieser Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie Lichtenbergstr. 4, Garching in Zusammenarbeit mit der Europäischen Arbeitsgruppe für die Prolaminanalyse und -toxizität und den Partnern des BMBF-Leitprojekts „Zöliakie“ 1

2 Definition Zöliakie = Einheimische Sprue = Glutensensitive Enteropathie: Lebenslange Intoleranz gegenüber Speicherproteinen (Gluten) aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer (?), die mit einer schweren Schädigung der Dünndarmschleimhaut (Zottenatrophie) einhergeht und zur Malabsorption von essentiellen Nährstoffen führt Darmzotten normal zöliakiegeschädigt 2

3 Symptome/Therapie Häufige Symptome Therapie Durchfälle Anämien
Erbrechen Avitaminosen Leibblähungen Knochenschmerzen Blässe Osteoporose Gedeihstörungen Muskelschwund Wesensveränderung Gewichtsverlust Therapie Lebenslange strikte „glutenfreie Diät“ = keine Produkte aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer außer reiner Stärke (Tägliche Aufnahme von Gluten < 20 mg) 3

4 Chronik der Zöliakie 200 a.d.
Patienten mit chronischem Durchfall = „koiliakos“ 1888 Beschreibung der Zöliakie, Behandlung durch Diät 1950 Toxische Wirkung von „Gluten“  „glutenfreie Diät“ 1959 Peptisch-tryptisches Glutenhydrolysat = toxisch 1960 Zöliakie und Einheimische Sprue = identische Krankheit 1961 Diagnose durch Dünndarmbiopsie 1970/71 Toxizitätsprüfung von Proteinen (in-vivo, in-vitro) 1984/88 Strukturaufklärung toxischer Peptide 1997 Gewebetransglutaminase = Autoantigen 4

5 Diagnose Empfehlungen der ESPGAN 1970 1990 Symptome Symptome
1. Biopsie  Atrophie 1. Biopsie  Atrophie IgA anti-Gliadin + IgA anti-TG + glutenfreie Kost glutenfreie Kost 2. Biopsie  Regeneration keine Beschwerden glutenhaltige Kost Diagnose „Zöliakie“ 3. Biopsie  Atrophie Diagnose „Zöliakie“ 5

6 Aktuelle Aspekte Häufigkeit Antigen „Gluten“
Autoantigen „Transglutaminase“ Mechanismus Analytik Toxische Strukturen 6

7 Eisberg-Modell nach Logan (1991)
Häufigkeit Eisberg-Modell nach Logan (1991) 1 : 200 1) Diagnostizierte Zöliakie 2) Nicht-diagnostizierte Zöliakie (flache Mukosa) 3) „Latente“ Zöliakie (normale Mukosa, erhöhte Ig-Werte) Familien = 1 : 10, weiblich: männlich = 2:1 Genetische Disposition (HLA-DQ2) = 1 : 5 7

8 Klassifizierung der Getreidemehlproteine
Stoffwechselproteine Speicherproteine wasserlöslich salzlöslich alkohollöslich unlöslich ALBUMINE GLOBULINE PROLAMINE GLUTELINE Weizenprolamine = GLIADINE Weizengluteline = GLUTENINE Gliadine + Glutenine = GLUTEN (Kleber) 8

9 Aminosäurezusammensetzung der Prolamine
mol-% (Ausschnitt) (Wieser et al., 1980) 9

10 Homologe Gruppen der Speicherproteine
Mrx10-3 Weizen Roggen Gerste HMW 67-88 HMW-Glutenine (G) HMW-Secaline (G) D-Hordeine (G) MMW 34-55 -Gliadine (P) -Secaline (P) C-Hordeine (P) LMW 28-39 (70) -Gliadine (P) -Gliadine (P) LMW-Glutenine (G) - -40k-Secaline (P) -75k-Secaline (G) - -Hordeine (P) B-Hordeine (G) HMW = hochmolekular (P) = Prolamine MMW = mittelmolekular (G) = Gluteline LMW = niedermolekular 10

11 2-Dimensionales Modell eines -Gliadins
(Müller, Wieser 1997) 11

12 Toxizität der Kleberproteine
-/+ 12

13 Toxizität von Hafer Bis 1995 umstritten 1995 Finnische Studie
(Janutuinen et al.) 92 Zöliakiekranke, 6-12 Monate 45: ca. 50 g Hafer pro Tag 47: 0 g Hafer pro Tag Biopsie Ergebnis: nicht toxisch ! 1996 Irische Studie I (Srinivasan et al.) 10 Zöliakiekranke, 3 Monate 50 g Hafer (Kölln) pro Tag Biopsie, immunol. Unters. 2003 Norwegische Studie (Lundin et al.) 19 Zöliakiekranke, 3 Monate 50 g Hafer pro Tag Biopsie, immunol. Unters. Ergebnis: 1 Patient: Villusatrophie 5 Patienten: -Interferonanstieg 2003 Irische Studie II (Kilmartin et al.) 17 Zöliakiekranke Gewebekultur-Test PT-Avenin, PT-Gliadin immunol. Untersuchung Ergebnis: nicht toxisch ! 13

14 Autoantigen Gewebetransglutaminase (tTG)
1) R-CO-NH2 + H2N-tTG  R-CO-NH-tTG + NH3 tTG 2) R-CO-NH2 + H2O  R-CO-OH + NH3 LQLQPFPQLPY H2N-tTG LQLQPFPQPQLPY LQLQPFPELPY (Fleckenstein et al., 2004; Wieser et al., 2004) 14

15 Hypothesen zum Mechanismus
Enzymdefekte (Peptidasemangel) Lektinartige Reaktionen Adenovirus-12-Infektion Primäre (Auto-) Immunreaktionen (Glutenpeptide/ Transglutaminase) (Schuppan, Dieterich, 1999) 15

16 Analytik „Gluten“ Ausgangslage Probleme
A. CODEX STAN : Bestimmung des N-Gehaltes (Kjeldahl) Grenzwert: 0,05 % N in der TM Draft Revised Standard (2000) Extraktion mit 60 %igem Ethanol  ELISA Grenzwert: 20 mg Gluten/kg TM (von Natur aus „glutenfrei“) 200 mg Gluten/kg TM („glutenfrei“ gemacht) Gluten = 2 x Prolamin Codex Food Labelling Standard (2006 ?) Gluten = Allergen; Grenzwert  0 Prolaminstandard, Antikörper, erhitzte Lebensmittel, Hydrolysate Probleme 16

17 ELISA-Kit „Gluten“ (Skerritt u. Hill, 1991)
Kalibrierkurven für Gliadine verschiedener Weizenarten (Wieser, Seilmeier, 1999) 17

18 Herstellung eines Gliadinstandards
Weizenkörner 30 kg Lipide vermahlen, entfetten Salzextraktion 60 % Ethanol Albumine Globuline Rohgliadin Ultrafiltration, Lyophilisation Gliadin Chemische Charakterisierung Zertifizierung (IRMM) Standard  500 g (E. Berghofer, Wien; R. van Eckert, Graz; H. Wieser, Garching) 18

19 Herstellung eines Antikörpers/ELISA
Immunogen: Roggenprolamine (Secaline) Antikörper: monoklonal (R5) ELISA: Sandwich (R5 + R5-Meerrettichperoxidase) Spezifität: Gliadin, Secalin, Hordein (kein Avenin !) Epitop: - QQPFP - Nachweisgrenze: 3,2 µg Prolamin /kg Wiederholbarkeit: 7,7 % Reproduzierbarkeit: 8,1 % (Valdes et al., 2003) 19

20 Analyse von erhitzten Produkten (1)
Einfluss von 2-Mercaptoethanol auf die Kalibrierkurve des Gliadinstandards im R5-ELISA (Garcia et al., im Druck) 20

21 Analyse von erhitzten Produkten (2)
Wiederfindung von Gliadin in erhitzten Weizenteigen 60 % EtOH 2-ME + GUA °C °C M = Mehl = 100 % 21

22 Analyse von erhitzten Produkten (3)
Wiederfindung von Gliadin in Maisbrot Probe Zusatz Gliadina Gliadin (EtOH) Gliadin (2-ME+GUA) mg/kg % Maisbrotb Nr. 1 145,0 57,5 40 144,5 100 2 65,5 21,0 32 61,0 93 3 156,0 48,0 31 153,5 98 4 107,0 35,5 33 100,0 5 80,5 27,5 34 76,5 95 6 27,0 12,0 44 26,0 96 7 34,5 13,0 38 32,5 94 8 140,0 54,5 39 127,5 91 9 0,0 <1,5 - 10 a Gliadinstandard IRMM-480; Angaben entsprechen Gliadinprotein (= 86,4 % der Substanz). b Aus 10 g Mehl hergestellt und 10 min bei 240 °C verbacken. 22

23 Zusammenfassung Analytik
Mit dem monoklonalen Antikörper R5 werden die Prolamine von Weizen, Roggen und Gerste mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit quantitativ erfasst. Der kombinierte Einsatz von 2-Mercaptoethanol und Guanidin erlaubt die vollständige Extraktion der Prolamine auch aus erhitzten Produkten; die Effizienz des Antikörpers wird durch das Extraktionsmittel nicht beeinträchtigt. In naher Zukunft wird ein zertifizierter Gliadinstandard zur Verfügung stehen. Das entwickelte ELISA-System wurde in einem internationalen Ringtest erfolgreich getestet und vom „Codex Commitee on Methods of Analysis and Sampling (CCMAS)“ anerkannt. Seit kurzem sind kommerzielle Testkits erhältlich. Haferprolamine und Weizenglutenine werden nicht erfasst. 23

24 BMBF - Ideenwettbewerb
BMBF - Leitprojekt Entwicklung von Weizen-, Roggen-, und Gerstenproteinen ohne Zöliakietoxizität und deren Verwendung zur Herstellung von Lebensmitteln ( 24

25 Ziele Aufklärung toxischer Proteinstrukturen
Eliminierung toxischer Strukturen durch Gentechnologie Produktion von zöliakieverträglichem, transgenem Weizen Produktion von backfähigem, transgenem Mais Produktion von zöliakieverträglichem Gluten durch transgene Hefe 25

26 Partner Wissenschaft Industrie
Universität Hamburg Institut für Allgemeine Botanik und Botanischer Garten (H. Lörz, D. Becker) Technische Universität Berlin Fachbereich für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie (U. Stahl, F. Meuser) St. Thomas´ Hospital, London Rayne Institute (P.J. Ciclitira) Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie, Garching Arbeitskreis Getreideproteine (H. Wieser) Industrie Hauptsponsoren: Monsanto, Uniferm, Puratos, Bake Mark Verein zur Förderung und Verwertung von gentechnisch verbesserten Getreideprodukten 26

27 Teilprojekte Garching/London
Identifizierung und Modifizierung toxischer Epitope aus Gliadinen  Immunmodulation ? Toxizitätsprüfung von Gluteninen  Einsatz in glutenfreien Backwaren ? 27

28 Toxizitätstests In-vivo-Test (Instillation in den Dünndarm) 500 – 1000 mg In-vitro-Test (Gewebekultur-Test) 1 mg In-vitro-Test (Stimulation der T-Lymphozyten) 0,2 mg 28

29 Zöliakieaktivität synthetischer Gliadinpeptide
(in vivo, Sturgess et al., 1994; in vitro, Shidrawi et al., 1995) (in vivo, Marsh et al., 1995; in vitro, Maiuri et al., 1996) 29

30 Stimulation der T-Lymphozyten durch Gliadinpeptide
 Zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten (in-vitro) durch Peptide aus -Gliadinen (57-68, 62-75) nach Desamidierung von Q65  E65 durch Transglutaminase (Arentz-Hansen et al., 2000) ! Kein Nachweis, dass diese Peptide in-vivo die Darmschleimhaut schädigen ! Keine systematische Untersuchung, welche Aminosäuren außer E65 für die stimulierende Wirkung essentiell sind 30

31 Methoden (1) Gliadinhydrolysat Synthetische Peptide
 Extraktion von Gliadin aus Weizenmehl der Sorte „Rektor“ mit 60 % (v/v) Ethanol  Partialhydrolyse von Gliadin mit trägergebundenem Pepsin und Trypsin ( PT-Gliadin) Synthetische Peptide Gerät: Peptidsynthesizer (Applied Biosystems 431A) Programm: Fmoc-Chemie, Small-Scale-Synthese (1 mmol/Aminosäure) Reinigung: 1) C18-Kieselgel (25-40 µm), Glassäule 3 x 30 cm, ca. 20 °C 2) C18-Kieselgel (5 µm), Stahlsäule 0,46 x 24 cm, 50 °C Reinheitsprüfung: RP-HPLC an C18-Kieselgel Identitätsprüfung: Massenspektrometrie (ESI-MS) 31

32 Immunologische Untersuchungen Toxikologische Untersuchungen
Methoden (2) Immunologische Untersuchungen T-Lymphozyten: Isolierung von gliadinsensitiven T-Zelllinien und -klonen von Zöliakiepatienten Stimulation: PT-Gliadin + Antigen-präsentierende Zellen (APC) Inkubation: T-Zellen + APC + Peptid (3,7 µmol/L) + 3H-Thymidin (18-48 h, 37 °C) Messung: Radioaktivität (cpm) cpm mit Peptid Stimulationsindex = SI > 2,0 = signifikante Wirkung cpm ohne Peptid Zytokine: ELISA Toxikologische Untersuchungen Personen: 4 erwachsene Zöliakiepatienten unter glutenfreier Kost Instillation: 1 g PT-Gliadin, 100 bzw. 20 mg Peptid, gelöst in Wasser, 2 h Biopsie: Gewebeentnahme mit Quinton-Kapsel nach 0, 2, 4 und 6 h Messung: Enterozytenhöhe (ECH), Villushöhe (VH), Kryptentiefe (CD), Anzahl intraepithelialer Lymphozyten (IEL) 32

33 Gewebeentnahme Intraepitheliale Lymphozyten Villus- höhe
Zellhöhe l Villus- höhe Krypten -tiefe (Messung an mind. 10 Villi) 33

34 Immunologische Untersuchung
Peptide Toxikologische Untersuchung G8 (-Gliadin 56-75) C1 (ß-Casein 53-72) Immunologische Untersuchung G9 (-Gliadin 56-75, E65) G5 (-Gliadin 56-68, E65) G4 (-Gliadin 62-75, E65) 34

35 Toxikologische Untersuchung (1)
Enterozytenhöhe (ECH) (0 h vs. 4 h) PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8 = Gliadinpeptid  56-75 C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle) 35

36 Toxikologische Untersuchung (2)
Villushöhe/Kryptentiefe (VH/CD) (0 h vs. 4 h) PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8 = Gliadinpeptid  56-75 C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle) 36

37 Toxikologische Untersuchung (3)
Anzahl der Lymphozyten (IEL) (0 h vs. 4 h) PTG = peptisch-tryptisches Gliadinhydrolysat (Positivkontrolle) G8 = Gliadinpeptid  56-75 C1 = Caseinpeptid (Negativkontrolle) 37

38 Immunologische Untersuchung (1)
T-Zellklon Nr. 6 Peptid SI IFN G9 ( 56-75) 60 1100 G5 ( 56-68) 11 130 G4 ( 62-75) 49 380 T-Zellklon Nr. 8 Peptid SI IFN G9 ( 56-75) 25 410 G5 ( 56-68) 5 37 G4 ( 62-75) 22 33 T-Zellklon Nr. 9 Peptid SI IFN G9 ( 56-75) 27 430 G5 ( 56-68) 12 220 G4 ( 62-75) 410 Sl = Stimulationsindex, IFN = -Interferon (pg/mL) 38

39 Immunologische Untersuchung (2)
Peptide SI/IFN (-) - - - - - - - - + + + + 39

40 Immunologische Untersuchung (3)
Peptide SI/IFN + + + + + + - - 40

41 Zusammenfassung Toxikologie/Immunologie
Die in-vivo-Toxizitätsprüfung an vier erwachsenen Zöliakiepatienten hat gezeigt, dass das Peptid G8 ( 56-75) eine signifikante zöliakiespezifische Schädigung der Dünndarmschleimhaut hervorruft. Die immunologischen Untersuchungen haben ergeben, dass das an Position 65 desamidierte Peptid G8 (G9) eine zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten bewirkt. Für die Wirkung des Peptids sind die Positionen essentiell. 41

42 Peptidbindungsstellen
42

43 Toxizitätsprüfung der HMW-Glutenine
Bauplan 90 785 1Dx5 A B C 827 105 585 1Dy10 A B C 627 Wiederkehrende Sequenzen 43

44 Preparation of Crude HMW Subunits
Flour (Rektor) 50 % 2-PrOH (3x, RT) Extract Residue 50 % 2-PrOH + DTE + Tris-HCl (2x, 60 °C) Extract Residue Solubles Precipitate washing, freeze-drying acetone 1Dx % 1Bx % 1By % 1Dy % HMW subunits 44

45 RP-HPLC of Glutenin Fractions
Total glutenin subunits Crude HMW subunits HMW  90 % HMW  20 % 45

46 Characterisation of Purified HMW Subunits
RP-HPLC SDS-PAGE 46

47 ELISA-Result Antibody Gliadin
R5 (Mendez et al., Madrid) a) Sandwich b) Competitive 0.09 % 0.16 % W6/8 (Ellis et al., London) 0.18 % 47

48 Peptic Tryptic Digest of HMW Subunits
Control of hydrolysis by RP-HPLC on C18 silica gel HMW subunits (400 mg) + agarose-bound pepsin (1600 U) + HCl (pH 2, 20 mL) 37 °C, 2 h – centrifugation Supernatant +NaOH ( pH 7.8) + agarose-bound trypsin (10 U) 37 °C, 2 h + HCl ( pH 7.0) – centrifugation – lyophilisation of supernatant 48

49 Stimulationstest an T-Lymphozyten
Patient FFIII HMW HMWtTG ZB 11,1 2,6 1,4 JB 6,2 2,0 JD 3,7 3,4 3,3 YR 12,5 1,0 3,0 SB 1,3 3,1 BL 90,0 12,1 7,7 TS 6,1 3,9 MH 4,3 0,3 0,2 EL 11,9 1,5 2,2 LN 4,0 1,1 MT 67,0 Nd 4,2 CM 11,0 3,5 5,2 NL 21,5 0,7 LB  13/14 7/13 8/14 Angegeben ist der Stimulationsindex (SI); SI>2 = signifikante Wirkung; Nd = nicht bestimmt. 49

50 Ergebnisse ECH 50

51 Ergebnisse VH/CD 51

52 Ergebnisse IEL 52

53 Zusammenfassung HMW-Glutenine
Die immunologischen und toxikologischen Untersuchungen haben ergeben, dass ein Gemisch aus den HMW-Untereinheiten Nr. 5, 7, 9 und 10 zöliakiespezifische Reaktionen hervorruft. Aus den Ergebnissen geht nicht hervor, welche der vier Untereinheiten zöliakieaktiv ist. 53

54 Ausblick Isolierung und Testung einzelner rekombinanter HMW-Untereinheiten aus transgenem Mais und transgener Hefe Mais (Uni Hamburg) Hefe (TU Berlin) 1Dy10 1Dx5 54

55 Bundesministerium für Bildung und Forschung
Danksagung Prolamin Working Group Paul J. Ciclitira, London Renate van Eckert, Graz Conleth Feighery, Dublin Enrique Mendez, Madrid BMBF-Projekt Dirk Becker, Hamburg Paul J. Ciclitira, London Erika Hinzmann, Berlin Friedrich Meuser, Berlin Bundesministerium für Bildung und Forschung Verein zur Förderung und Verwertung von gentechnisch verbesserten Getreideprodukten DFA Wolfgang Engel, Ursula Schützler, Sibylle Suckart 55