Hauptseminar Comparative Analysis of Spatial Patterns of Gene Expression in Drosophila melanogaster Imaginal Discs Henrik Failmezger.

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1 Hauptseminar Comparative Analysis of Spatial Patterns of Gene Expression in Drosophila melanogaster Imaginal Discs Henrik Failmezger

2 Räumliche Genexpressionsmuster
Zur Untersuchung der Genexpression werden typischerweise Microarray - Experimente durchgeführt Untersuchung der Expression von Genen im großen Stil möglich Bieten Informationen welche Gene zu einem gewissen Zeitpunkt exprimiert werden Aber: Liefern meist keine räumliche Information

3 Warum räumliche Genexpressionsmuster ?
Man will wissen: In welchen Geweben werden Gene exprimiert ? Welche Gene werden zusammen exprimiert ? Wie werden Gene räumlich reguliert ? Welche Expressionsmuster ähneln sich ? Beantwortung dieser Fragen wichtig - zum Beispiel für die Entwicklungsbiologie

4 Herstellung: Zur Erstellung räumlicher Expressionsmuster werden Gene in Situ hybridisiert

5 Ansatz der FlyEx-Datenbank
Enthält Bilder von Drosophila Embryos in verschiedenen Entwicklungsphasen jeder Zellkern des Embryos hat folgende Eigenschaften: Identifikationsnummer Position des Zellkerns Expressionslevel

6 Netzwerk räumlicher Expressionsmuster
Räumliche Genexpressionsmuster sollen visualisiert und analysiert werden Netzwerke können räumliche Interaktionen messen und bewerten Netzwerk muss auf die räumliche Komponente der Expression Rücksicht nehmen

7 Eigenschaften räumlicher Expressionsmuster
Farbintensität eines Zellkerns Position des Zellkerns Position und Farbintensität der Nachbarzellkerne Informationen lassen sich zum Aufbau eines Netzwerks verwenden

8 Aufbau des Netzwerks: Knoten stellen Expressionselemente dar
Zelle Zwei Knoten {i,j} werden durch eine Kante verbunden: 1.) Die Knoten haben ähnliche Expressionsintensität Identifiziert Expressionskorrelationen zwischen Nachbarzellen 2.) Knoten liegen nicht weiter als eine Maximaldistanz auseinander Betont die Lokalität der Genexpression

9 Mathematisch formuliert:
Paar von Knoten {i,j} wird verbunden, wenn die Bedingung gilt: Position des Zellkerns Expressionslevel

10 Knotengrad: Anzahl der Kanten des Knotens
Knotengrad steigt mit der Korrelation der Expressionsintensität Induziert mögliche Kommunikation zwischen den Zellen

11 Clusteringkoeffizient:
Je höher der Clusteringkoeffizient, desto ähnlicher die Expressionsmuster Der Clusteringkoeffizient charakterisiert den Genexpressionskontext einer Zelle Der Durchschnittsclusteringkoeffizient des ganzen Netzwerks <C> kann als Maß für die allgemeine Verbundenheit des Netzwerks verwendet werden

12 Alternative Netzwerke:
Zum Aufbau des Netzwerks können auch andere Kriterien herangezogen werden: Antikorrelation: Wie unähnlich sind sich Expressionsmuster ? Zellhemmung kann untersucht werden Zeitliche Korrelation: Wo wird das Gen zur gleichen Zeit exprimiert ?

13 Mit räumlichen Genexpressionsmustern lassen sich wichtige Aussagen über die Rolle von Genen - besonders in der Entwicklung von Organismen - treffen Aber: In Situ Hybridisierung ist ineffizient, höchsten drei Gene können gleichzeitig in einem Embryo hybridisieren Automatische Methoden zur Erstellung und Analyse von räumlichen Genexpressionsmustern sind nötig

14 Methode von C. L. Harmon Automatische Erstellung von räumlichen Expressionsmustern in Imaginal Discs von Drosophila Melanogaster Automatisierte Suche, Extrahierung und Bewertung von Imaginal Discs im Bildmaterial Generierung von Genexpressionskarten für jedes Gen Clustering der Genexpressionskarten

15 Imaginal Discs Undifferenzierte Strukturen in der Insektenlarve, aus denen sich während der Verpuppung Körperteile der erwachsenen Insekten bilden Flügel, Auge, Antenne, Kopf, Extremitäten Lebenszyklus von Drosophila:

16 Puppe Fliege

17 Antenne + Auge Puppe Fliege Bein Flügel Haltere Genitalien

18 Die spätere Struktur von Imaginal Discs ist determiniert
Antenne + Auge Puppe Fliege Bein Flügel Haltere Genitalien Die spätere Struktur von Imaginal Discs ist determiniert

19 Genexpressionskarten und
Ablauf: Hybridisierung Extraktion von Vordergrundregionen Aufnahme von Photos Manuelle Segmentierung von Imaginal Discs Alignment Bewertung des Färbegrads Erstellung von Genexpressionskarten und Clustering Generierung von Shape Models

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21 Genexpressionskarten und
Ablauf: Hybridisierung Extraktion von Vordergrundregionen Aufnahme von Photos Manuelle Segmentierung von Imaginal Discs Alignment Bewertung des Färbegrads Erstellung von Genexpressionskarten und Clustering Generierung von Shape Models

22 Erstellung von Shape Models:
Consensus Shape Model

23 Genexpressionskarten und
Hybridisierung Extraktion von Vordergrundregionen Aufnahme von Photos Manuelle Segmentierung von Imaginal Discs Bewertung des Färbegrads Alignment Erstellung von Genexpressionskarten und Clustering Generierung von Shape Models

24 Extraktion von Vordergrundregionen:
Vordergrundregionen sollen aus dem Bildmaterial extrahiert und mit den Shape Models verglichen werden Das Bildmaterial enthält Pixelvariabilitäten Streuung, Absorption von Licht durch das Material Vor dem Alignment sind Bildbearbeitungsschritte nötig

25 Laplace-Filter Mit dem Laplace-Filter ist eine Kantenschärfung von Vordergrundregionen möglich Führt beim Alignment zu einer besseren Dedektion von Imaginal Discs Nutzt die zweite Ableitung der Bildfunktion Anwendung:

26 Funktion: ursprüngliches Bildprofil: erste Ableitung der Bildfunktion:
zweite Ableitung der Bildfunktion: geschärfte Funktion:

27 Genexpressionskarten und
Hybridisierung Extraktion von Vordergrundregionen Aufnahme von Photos Manuelle Segmentierung von Imaginal Discs Bewertung des Färbegrads Alignment Erstellung von Genexpressionskarten und Clustering Generierung von Shape Models

28 Alignment Alignment von Bildern Sequenzalignment AATGGC || || AAGCGC
|| || AAGCGC Buchstaben an einer Position werden verglichen Farbintensitäten an einer Position werden verglichen Gaps: Affine Transformation: AAT-GGC || || AAGCGC- Drehung Skalierung Spiegelung

29 Problem bei Binärbildern:
Großer Unterschied in den Farbintensitäten schon bei kleinsten Pixelverschiebungen Distanztransformation

30 Distanztransformation
Für jede Bildposition wird bestimmt, wie weit sie geometrisch vom nächsten Vordergrundpixel entfernt ist Auf Basis der Distanz wird den Hintergrundpixeln ein Grauwert zugeordnet

31 Koordinaten: p = (r,s), p‘=(r‘,s‘)
Koordinaten: p = (r,s), p‘=(r‘,s‘) Euklidische Distanz:

32 Distanzmatrix Zielbild und Shape Model soll ein Score basierend auf einem Distanzmaß zugeordnet werden Die normalisierte Crosskorrealtions -Distanz wird verwendet um zwei Bilder zu vergleichen

33 Seien distanztransformierte
Bilder: Normalisierte Crosskorrelation: NCC gibt einen Wert zwischen 0 und 1 zurück Falls NCC = +1, so matchen die Bilder perfekt

34 Die normalisierte Crosskorrelation ist inkonsistent
gegenüber Drehungen und Größenänderungen Affine Transformation muss gesucht werden, welche die normalisierte Crosskorrelation maximiert

35 for each config in initialConfigurationList
for iteration = 0 to maxIterations origScore = NCC(target, model) for x in config xDown = x - stepSize stepDownImage = AffineTransformImage(target, xDown, config) stepDownScore = NCC(stepDownImage, model) if stepDownScore > origScore then x = xDown xUp = x + stepSize stepUpImage = AffineTransformImage(target, xUp, x) stepUpScore = NCC(stepUpImage, model) if stepUpScore > Max(origScore, stepDownScore) then x = xUp config = Update(x, config) alignedTarget = AffineTransform(target, config) Return(alignedTarget)

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37 Genexpressionskarten und
Ablauf: Hybridisierung Extraktion von Vordergrundregionen Aufnahme von Photos Manuelle Segmentierung von imaginal discs Alignment Bewertung des Färbegrads Erstellung von Genexpressionskarten und Clustering Generierung von Shape Models

38 Berechnung des Stain Scores:
Naiv: Blaukanal Rotkanal Grünkanal Führt zu Problemen in Gebieten starker Färbung Verbessert:

39 Genexpressionskarten und
Ablauf: Hybridisierung Extraktion von Vordergrundregionen Aufnahme von Photos Manuelle Segmentierung von imaginal discs Alignment Bewertung des Färbegrads Erstellung von Genexpressionskarten und Clustering Generierung von Shape Models

40 Genexpressionskarten:
Verschiedene Expressionsbilder eines Gens in einer Imaginal Discs werden zu Expressionskarten zusammengefasst Pixelwert in der Expressionskarte ist der Mittelwert von allen alignierten Bildern Expressionskarte des Gens dr1

41 Anwendung von Genexpressionskarten
Neue Bilder können extrahiert, aligniert und mit der Expressionskarte anderer Gene verglichen werden Doc1: Transkriptionsfaktor Pepck: Phosphoenolpyruvat Carboxykinase Cyp310a1: Elektronencarrier Doc2: Transkriptionsfaktor

42 Overlay Maps: Aus den Expressionsmustern
mehrer Gene können Overlay Maps gebildet werden Drm: Bindung von Nucleinsäuren TIMP: metalloendopeptidase inhibitor activity BG:DS :

43 Clustering Gemeinsame Eigenschaften verschiedener Gene lassen sich durch Clustering feststellen Clustering ähnlicher Expressionsmuster: Clustering von Pixeln: Pixel mit ähnlichen Expressionsprofilen werden geclustert

44 Pixel Clustering Notum

45 Zusammenfassung Genexpressionsmuster von 130 Genen wurden untersucht
Die Methode arbeitet in 85% der Fälle adäquat Fehler bei mehreren Imaginal Discs in einem Bild und starker biologischer Verschmutzung Für die Zukunft: Mehrere Imaginal Discs in einem Bild sollen erkannt werden Die Methode soll robuster gegen biologische Störungen werden Hierarchisches Clustering soll verwedet werden