DNA: Bausteine des Lebens Konzeption und Kursleitung: Frühjahrsprogramm 2008 DNA: Bausteine des Lebens Konzeption und Kursleitung: Pascale Ohnsorg Philipp Taxböck Michael Röthlisberger Organisation: Dr. Peter Jann 1

Theorie Restriktionsenzyme Ansetzen des Verdaues Begrüssung, Rückblick Theorie Restriktionsenzyme Ansetzen des Verdaues Auswertung Experiment mtDNA p Kursleiter 3. Teil: Philip Taxböck & Michael Röthlisberger

P rückblick

P übersicht

Repetition - DNA Deoxyribonucleic Acid Desoxyribonucleinsäure 5 M Repetition DNA 5

Auszug aus puc19. Ziemlich unübersichtlich Auszug aus puc19. Ziemlich unübersichtlich! Datenmengen nur mit computer bearbeitbar! D.h. auch computer sind essentielle voraussetzung der molekularbio.

Restriktionsenzym Restriktion Enzym Anderes absolut essentielles werkzeug: restriktionsenzyme! Name: rstriktion = beschränkung enzym= Proteine, die eine chemische Reaktion katalysieren können Restriktion Enzym

Grafik etwas verwirrend, da rest-enzyme zwar schneiden, aber nicht „essen“, d.h. nichts geht verloren. Hier eingezeichnet: rest enzyme erkennen spez sequenz (meist zw 4 und 8 bp, machmal länger)

Enzym erkennt, schneidet.

Dann doppelstrang ist entzweit.

5`-GAATTC-3` EcoR1 3`-CTTAAG-5` 5`-CTNAG-3` Dde1 3`-GANTC-5` 5`-GCCNNNNNGGC-3` 3`-CGGNNNNNCCG-5` Dde1 Bgl1 EcoR1 Drei beisiele unterschiedlicher sequenzen, die erkannt werden. N in unterstem beispiel beliebige base. Erkennnungs-sequenz nicht gleich schnittsequenz. Damit beide stränge geschnitten werden können, ist die sequenz palindromisch.

Restriktionsenzyme – Herkunft der Namen Bakterium Beschreibung EcoR1 Escherichia coli Darm von Tier und Mensch, gerade Stäbchen Bgl1 Bacillus globigii Harmlos für Menschen, allgegenwärtig in herumfliegendem Staub, Stäbchen Dde1 Desulfovibrio desulfuricans Sulfat reduzierendes Bakterium, weit verbreitet, gekrümmte Stäbchen m

pUC 19 Plasmid 2686 Basenpaare lang Wieder ausschnitt aus unserem plasmid puc19. Finden sie die sequenz gaattc? Auf palindrom nochmals eingehen. pUC 19 Plasmid 2686 Basenpaare lang

Warum gibt es Restriktionsenzyme? Werner Arber, *1929 in Gränichen Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 1978 Für uns im labor rest-enzyme wichtig, aber: Was ist der biologische sinn? Arber in 60 er jahren: fremde dna wird in Bakterien zerschnitten. Nathan smith isolierte die enzyme, hamilton o. smith ebnete weg zur anwendung Molekularbiologie ein Spezialgebiet der Biologie, das sich mit den Reaktionsmechanismen zwischen und innerhalb von molekularen Strukturen der Organismen befasst.

Warum gibt es Restriktionsenzyme? Schematisch dargestellt: ohne rest enzyme. 15

Warum gibt es Restriktionsenzyme? Mit enzymen. Frage: warum wird Bakterien-dann nicht zerschnitten?! Methylierung. --> was ist wenn phage dann auch methyliert? --> arms race, wettrüsten

P: übersicht praktischer teil.

p.

2 P&m

Pause

Wie gross werden die Fragmente sein?

DNA-Plasmid pUC-19 M: erkläre kurz MCS, Ori, Amp, LacZ

M: Da bereits mit kleinen plasmiden eher kompliziert, braucht man für das bearbeitenm grösserer Plasmide computer. Ohne sie wäre Molek unmöglich. XXX

 Eco RI: 396 Schnittstelle bestimmen  Bgl I: 245,1813  Dde I: 171,1081,1490, 1656, 2196, 2622 M: zeichne beispiel mit 2 enzymen an tafel.

Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2. Teilstücke berechnen 2686 500 Gesamtlänge 2686 bp 2686 500 1000 Etc. ...

 Eco RI: 396 Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2. Teilstücke berechnen  Eco RI: 396 Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2686 396 500 1000 26

 Eco RI: 396 Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2. Teilstücke berechnen  Eco RI: 396 Eine Schnitt- stelle  Ein Fragment Länge des Fragmentes: ??? Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2686 396 500 1000 27

 Eco RI: 396 Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2. Teilstücke berechnen  Eco RI: 396 Eine Schnitt- stelle  Ein Fragment Länge des Fragmentes: ??? Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2686 396 500 1000 28

 Eco RI: 396 Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2. Teilstücke berechnen  Eco RI: 396 Eine Schnitt- stelle  Ein Fragment Länge des Fragmentes: 2686 bp Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2686 396 500 1000 29

 Bgl I: 245,1813 Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2. Teilstücke berechnen  Bgl I: 245,1813 Zwei Schnitt- stellen  Zwei Fragmente Länge der Fragmente: Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2686 245 500 1813 1000 30

 Bgl I: 245,1813 Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2. Teilstücke berechnen  Bgl I: 245,1813 Zwei Schnitt- stellen  Zwei Fragmente Länge der Fragmente: 1118, 1568 Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2686 245 500 1813 1000 31

 Dde I:171,1081, Plasmid puc 19 Gesamtlänge 2686 bp 2. Teilstücke berechnen  Dde I:171,1081, 1490,1656, 2196, 2622 Drei Schnitt- stellen  Drei Fragmente Länge der Fragmente: 166, 235, 409, 426, 540, 910 Plasmid puc 19 2622 Gesamtlänge 2686 bp 2686 171 500 2196 1000 1656 1081 1490 32

Bakterien produzieren menschliches Insulin Eine der ersten Anwendungen der Gentechnologie 34

Ein Beispiel aus der Praxis: Das Insulin Nach dem Essen: Blutzuckerspiegel Insulin wird von der Bauchspeicheldrüse hergestellt Der Zuckergehalt im Blut sinkt, da Körperzellen den Zucker durch Insulin aufnehmen und verarbeiten (Energiegewinnung) Bei fehlendem oder funktionslosem Insulin: Blutzuckerspiegel bleibt - Durst - Sehstörungen - Harndrang - Infektionen - Müdigkeit - Gewichtsverlust - Kraftlosigkeit - Koma 35

Ein Beispiel aus der Praxis: Das Insulin Gegen die Zuckerkrankheit gab es Anfang des 20. Jahrhunderts kein anderes Mittel als Hungern. 36

Ein Beispiel aus der Praxis: Das Insulin Frederick Banting hat als erster Forscher Insulin aus den Bauchspeicheldrüsen von Hunden gewonnen 37

mtDNA-Experiment: Ueberblick -Mundschleimhaut gewonnen -mitochondriale DNA (mtDNA) isoliert -Gezielt eine sehr individuelle Region der mtDNA vervielfältigt („HVR1“) -Vervielfältigte Sequenzen gelesen Analyse der Sequenzen

mtDNA-Experiment: Die Sequenzen

Die Cambridge Reference Sequence mtDNA-Experiment: Die Cambridge Reference Sequence -Die mtDNA eines/einer Europäer/in wurde sequenziert, die Sequenz im Jahre 1981 im Fachmagazin „Nature“ publiziert -inzwischen leicht korrigiert -Jede heutige mtDNA Analyse zeigt als Resultat die Abweichungen zu dieser Cambridge Reference Sequence -Die Abweichungen sind spezifisch für bestimmte Völkergruppen

mtDNA-Experiment: Völkerwanderung Zwischen 40% und 60% der Europäer (sowie auch die CRS) gehören einer Haplotyp H Subklasse an.

mtDNA-Experiment: Die Haplogruppen -Verschiedene Völkergruppen unterscheiden sich also verschieden stark von der Cambridge Reference Sequence (H2b) -Die Unterschiede bestehen in verschiedenen Basen-Varianten an bestimmten Stellen in der mtDNA-Sequenz -Untersucht man alle diese Stellen, kann man aus der Kombination dieser Varianten seine „Haplogruppe“ ablesen -Unsere Analyse reicht nur für einige dieser Stellen, deshalb können wir unsere mtDNA nicht sicher einer Haplogruppe zuteilen, sondern nur ungefähr

mtDNA-Experiment: Sequenzunterschiede D-Loop mit hypervariabler Region 1 (HVR1) …AGTCGTAGTCGGTAACTGA… C T mtDNA: 16569 bp

Sequenzanalyse in silico mtDNA-Experiment: Sequenzanalyse in silico

mtDNA-Experiment: Resultate Position Cambridge Pers. X Pers. Y Pers. Z 16278 C T 16291 16294 16296 19391 16362

Vergleich der eigenen Daten mtDNA-Experiment: Vergleich der eigenen Daten -z.B. www.mitosearch.com Oder www.genpat.uu.se/mtDB/ www.isogg.org/famousdna.htm

mtDNA-Experiment: Resultate Position Cambridge Pers. X Pers. Y Pers. Z 16278 C T 16291 16294 16296 19391 16362 Haplogroup H? ??

Phylogenie - Stammbäume 48

49

ausgestorben Gibbons Orang Utan Gorilla Schimpanse Mensch 50

ausgestorben 24 –14 mya Heute Gibbons Orang Utan Gorilla Schimpanse Mensch 51

ausgestorben 24 –14 mya Heute Gibbons Orang Utan Gorilla 20 - 18 Schimpanse 12,5 Mensch 9 - 6 8 - 5 52

ATTT ATTG AATA AAAA 53

ATTT ATTG AATA AAAA 54

Outgroup ATTT ATTG AATA AAAA TTTT 55

56

Verschiedene Homo - Arten 57

Charles Darwin 58

Beispiel Adaptive Radiation Charles Darwin Vater der Evolu- tionstheorie ‘On the Origin of Species‘ 59

Beispiel Adaptive Radiation Entwicklung verschiedener Schnabelformen an verschiedene Nahrungsnischen angepasst 60

Beispiel Adaptive Radiation Knospen, Samen, Früchte Samen, Kerne, Früchte Blätter Insekten und Raupen 61

Beispiel Phylogenetik 19 11 Skabiose Drei unabhängige Verbreitungsgebiete Wo ist der Ursprung ? 8+1 Scabiosa s. str. S. columbaria. Figure 1: Simplified map of the 3 main distribution centers of Scabiosa s. str. and the number of species. 62

Beispiel Phylogenetik Genmaterial sammeln Molekularer Stammbaum Eine morphologisch ‘primitivere‘ Art als Referenz Verwandtschaftsanalyse Herkunft: Europa / Naher Osten Wanderung nach Afrika und Asien (Erdgeschichte) 63

Skabiose 64

Jetzt ists etwa 20.10, Pause ca. 15min.

Molekulare Uhr 66

Great moments in evolution 67

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!