Methodenvergleich PCR-SSP/SSO Testsysteme SSP:BAG,Dynal,Olerup SSO:Elpha,Dynal Reli

Vergleich SSP-SSO SSP: Sequenz spezifische Primer SSO: Sequenz spezifische Oligonukleotide Elpha: Enzyme linked probe hybridization essay Reli: reverse line dot blot essay

Vergleich SSP-SSO Überprüft auf : Eindeutigkeit des Ergebnisses Notwendigkeit von Wiederholungen Auflösungsvermögen und detektierte Allele methodische Probleme Auswertung Kosten und Materialverbrauch Zeitaufwand

Vergleich SSP - SSO SSP Ergebnis nach Amplifikation Zeitgewinn SSO Cyclerbedarf geringer Probendurchsatz größer DNA-Bedarf geringer oft bereits im low-resolution-Set hohe Auflösung

Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

Prinzip der PCR-SSP Primerannealing bei 37 - 72°C 5´ 3´ 3´ 5´ Antisenseprimer 3´ 3´ Senseprimer 5´

Prinzip der PCR-SSP Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet. 5´ 3´ 3´ 5´

Prinzip des Dynal RELI Strepavidin- Ziel-DNA wird mit konjugiertes Reportermolekül macht Bindung sichtbar (enzymatisch..) Ziel-DNA wird mit biotinmarkierten Primern amplifiziert und dena- turiert auf die Membran gegeben SSO-Moleküle werden auf Membran immobilisiert

Erscheinung des Reli-Test

Prinzip des Elpha Im letzten Schritt wird das Substrat, z.B. O-phenylene- diamin, als Farbreaktion umgesetzt Capture Oligo- nukleotid ist an Wand des Reaktions- gefäßes fixiert Streptavidin- reportermolekül ist mit Enzym gekoppelt, das Substratum- wandlung ver- mittelt PCR-amplifizierte biotinylierte DNA bindet an fixiertes SSO

Erscheinung Elpha-Test

Vergleich SSP - SSO SSP Elpha Reli

Vergleich SSP-SSO 27 Proben DRB und 26 Proben DQB in Vergleich je 4 Homozygote in DRB und DQB pro Probe DRB:BAG,Elpha,Reli DQB:Dynal/Olerup,Elpha, Reli 1 x DQB-SSP allein, 2 x DQB SSP-Reli

Vergleich SSP-SSO SSP Elpha Reli Cycler 47 Min 33,5 Min 48,75 Min (reine Ampl.) Detektion 18 Min 110 Min 100 Min (ohne Auswertung) DNA 12/30 µl 4/2 µl 4 µl (100 ng/ml) DNA 1:1 1:19/1:22 1:72 Verdünnung DQB DRB Schritte 2 12 21 ohne Amplifikation

Vergleich SSP-SSO Kosten pro Test SSP Elpha Reli Kitpreis pro Bestimmung DRB 37,- 65,- 45,- DQB 15/12 65,- 42,- Reagenzien dNTP-Puffer 10,5 Taq Polymerase 0,86/0,36 0,36 inklusive Restkosten Material, Fotographie, Zeit... 1,50 6/12Pf 6 Pf

Vergleich SSP-SSO Homozygotenerkennung SSP Elpha Reli DRB 1/4 1/4 1/4 erkannt 4,- nicht erkannt 3,-;15,-;13,- DQB 3/4 2/4 4/4 erkannt 6,-;2,- 6,-;2,- 6,-;2,- nicht erkannt 6,- 6,-;2,-

DRB-Allele der Sets

DQB-Allele der Sets

Reli-Auswerteprogramm

Elpha-Auswerteprogramm

Vergleich SSP-SSO Elpha-Frequenzentscheidung

Vergleich SSP-SSO Allelfrequenzen DQB (KM)

Vergleich SSP-SSO eindeutige Ergebnisse SSP Elpha Reli h/v a/v DR2 DR2 DRB 63% 85% 19% 52% 41% 70% SSP Elpha Reli alle Primerausfall DQB 93% 77% 75% 100%

Vergleich SSP-SSO Auflösung DRB SSP 15,5% Elpha h/v 82% a/v 19,6% Reli 48,3% DQB SSP 30% Elpha h/v 77% a/v 74% Reli 71%

Vergleich SSP-SSO Wiederholungen SSP Elpha Reli h/v a/v DR2 DR2 DRB - insgesamt 37% 15% 81% 41% 59% 30% - Ausfälle 19% 7% 11% - Ag Ausschl. 22% 7% 44% 26% - DR2 0% 4% 33% 30% DQB - insgesamt 7% 62% 0% - Ag Ausschl. 7% - Ausfälle 0% 15%

Vergleich SSP-SSO SSP-Problemfälle DRB: BAG-Set kann bei Vorliegen von DRB1*13 *1424 nicht sicher ausschließen bei Vorliegen von *13,- kann auch *1130 nicht ausgeschlossen werden bei Vorliegen von *3,- kann auch *1420 nicht ausgeschlossen werden Sets von Dynal oder Biotest zeigen dieses Problem nicht

Vergleich SSP-SSO SSP-Problemfälle DQB in einem Fall einer DQB1*06 Homozygotie war ein *0304 nicht auszuschließen in einem Fall einer DQB1*0301 Homozygotie war eine *03032 und *0306 nicht sicher auszuschließen DQ 3 Splitaufteilung nur in DQ 7 möglich

Vergleich SSP-SSO Elpha-Problemfälle DRB bei Vorliegen von DRB1*03/04 und *11/12 ist im Bewertungsmodus alle/vollständig auch *13 und *14 möglich zusätzlich sind bei Vorliegen von *03,*07,*11,*12,*08 ebenfalls *13 oder *14 möglich

Vergleich SSP-SSO Elpha-Problemfälle DQB in Primermixen A oder B trotz positiver Kontrollbande kein spezifisches Amplifikat in 31% der Amplifikationen; in diesen Fällen nur bei 75% korrelierendes Ergebnis Wenn in jedem Mix spezifisches Amplifikat korrektes Ergebnis in 78% d.F.

Vergleich SSP-SSO spezieller Fall Elpha DNA Probe 990606 SSP und Reli DQB1*02,- Elpha-Test: 1) alle Kontrollen positiv DQB1* 0301,0601 2) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 020x,030x 3) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 02,-

Vergleich SSP-SSO Reli-Problemfälle DRB Bei Vorliegen von 3,- oder 13,- Homozygotie ist auch heterozygote 13,3 möglich Bei HLA-DRB1*11,12 kann *13 nicht ausgeschlossen werden Im Falle DRB1*03,11 wird homozy- got 3,- oder 11,- von der Auswerte- software als wahrscheinlich angegeben

Vergleich SSP-SSO Reli Problemfälle DQB es steht keine Auswertesoftware zur Verfügung

Vergleich SSP-SSO spezieller Fall Reli DNA Probe 990291 SSP-Ergebnis DRB1*03,11 Reli Auswertesoftware: 1) 0308,- 2) 1109,- 3) 03xx,0308 4) 03xx,11xx reproduzierbar

Bewertung Elpha-Test Vorteile: Nachteile: stabile DRB Amplifikation automatisches Waschen Gesamtprozeß-automatisierung verfügbar Mit Update ist eine Auswertung auch früherer Daten hinsichtlich neuer Allele möglich für DR2-Auftrennung werden Primer mitgeliefert Nachteile: instabile DQB Amplifikation je nach Softwareeinstellung werden bestimmte Allele aus der Bewertung ausgeschlossen sehr abhängig von technischer Ausstattung, die bei Defekt die Testdurchführung unmöglich macht Pipettierarbeit zeit- und materialaufwendig Dokumentation der Reaktion nur als Photometermeßwerte im PC und auf Ausdruck viel Material nicht im Lieferumfang

Bewertung Reli-Test Vorteile: Nachteile: sehr stabile Amplifikationen Testdurchführung mit wenig Materialaufwand Streifen sind zur Dokumentation archivierbar HLA-A und -B bereits verfügbar kaum mechanische oder elektrische Geräte nötig Nachteile: für DQB keine Auswerte-software keine Automatisierung der Waschschritte oder des gesamten Ablaufs verfügbar schlechte optische Aufbereitung des Befundausdrucks

Bewertung SSP Vorteile: Nachteile: stabile Amplifikationen Fotos des Gelbildes zur Dokumentation archivierbar teilweise Automatisierung verfügbar Nachteile: hoher Platzbedarf im Thermocycler ausgefallene Amplifikationen machen Neuansatz des gesamten Sets nötig höhere Kosten für Polymerase mehr Ethidiumbromid-gele als Sonderabfall mehr Pipettieraufwand für einen Patienten