A probabilistic model for the evolution of RNA structure – Holmes RNA secondary structure prediction with simple pseudoknots – Deogun, Donis, Komina, Ma 01.06.2005

Gliederung Einführung Das TKF91 Modell Der TKF91 Structure Tree Vorstellung der durchgeführten Tests Interpretation der Ergebnisse 01.06.2005

Ergebnis des Humangenomprojekts: „Gut DREI Prozent brauchbares Material und jede Menge Schrott.“ Vergleich Genomgröße mit #Genen RNA kann mehr als genetische Infomration von A nach B zu tragen. Genetische Regulation, katalytische Funktion, Regulation zellulärer Prozesse 01.06.2005

snRNA Splicing von pre-mRNA guideRNA RNA-Editing in Mitchondrien Ribonukleasen Regulation der Biosynthese von tRNA tRNA Proteinbiosynthese rRNA Proteinbiosynthese Telomerase RNA DNA Synthese an chromsomalen Enden snoRNA Methylierung von rRNA Non-coding RNA kann nicht durch ORF Vorhersage gefunden werden 01.06.2005

Identifikation funktioneller Signale in einer Gensequenz. Idee: Ziel: Identifikation funktioneller Signale in einer Gensequenz. Idee: Funktionelle Signale sind evolutionär konserviert. Vorgehensweise: Fitten der Daten an probabilistische Modelle, die den evolutionären Prozess darstellen. 01.06.2005

Es existieren verschiedene Arten von konservierten Elementen x, y, z… Für jedes Szenario kann man ein probabilistisches Modell Mx, My, Mz erstellen. Die Likelihood der beobachteten Daten unter jedem dieser Modelle werden verglichen. Modell mit der besten Anpassung zeigt den Typ des funktionellen Elements. 01.06.2005

Es existieren zwei Vorgehensweisen zur Verwendung von evolutionärer Distanz: Trainingsalignments werden eingeteilt nach ihrer prozentualen Sequenz- identität. Alignments, die gleich eingeteilt wurden, repräsentieren dann Sequenzen mit äquivalenten Distanzen. (siehe BLOSUM) Evolutionäre Distanz wird als Zeitmessung betrachet. Man legt einen stochastischen Prozess zugrunde, mit konstanten Mutationsparametern. (siehe PAM) 2. Ansatz im Kontext der der likelihood-basierenden Methoden der Phylogenie besser, da kompatibler 01.06.2005

Bisherige Ansätze zur Identifikation von funktioneller non-coding RNA betrachten Sekundärstruktur nicht. Aber: Funktion und Struktur sind eng miteinander verknüpft In der Biologie ist Funktion immer bedingt durch Struktur Daher: Neues Modell betrachtet evolutionäre Entwicklung von Sekundärstruktur 01.06.2005

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Einfluss von 2 Arten von Mutations-Ereignissen: TKF91-Modell beschreibt die Evolution einer einzelnen Sequenz unter dem Einfluss von 2 Arten von Mutations-Ereignissen: 1. Punkt-Substitutionen 2. InDel-Ereignisse Die Raten der Mutations-Ereignisse sind unabhängig von benachbarten Ereignissen. 01.06.2005

Das Modell ist zeit-reversibel Es kann oBdA davon ausgegangen werden, dass eine der beiden Sequenzen die Ursequenz der anderen ist. 01.06.2005

Punkt - Substitutionen Positionen evolvieren unabhängig voneinander Zugrunde liegendes Substitionsmodell fij(t) = WS für Übergang von Base i nach j zur Zeit t s = Rate der Basensubstitution 01.06.2005

Insertionen - Deletionen  A  G  C  U  U  A  C  C  G  A  N+1 Positionen, an denen eingefügt werden kann - mit Rate  N Positionen, an denen gelöscht werden kann - mit Rate   <  vorrausgesetzt  kein Ungleichgewicht immortal link mortal links Jede Position = Markov Kette mit 4 Zuständen, auf der diese herumspringt. Gedächtnislosigkeit => neues Nukleotid nur vom letzten abhängig # überlebender Nachkommen ist geometrisch verteilt (wenn Urposition überlebt) 01.06.2005

Folgende Wahrscheinlichkeiten ergeben sich aus Raten n und n: n = Wahrscheinlichkeit einer Nicht-Deletion n = Wahrscheinlichkeit einer Insertion n = Wahrscheinlichkeit einer Insertion nach einer Deletion n = Wahrscheinlichkeit die Sequenz fortzuführen Außerdem ist Mn(i,j) die Substitutionswahrscheinlichkeit von Base i durch j 01.06.2005

Die Sequenzlänge im Gleichgewicht ist geometrisch verteilt, mit Parameter. Sequenzlänge im Gleichgewicht ist geometrisch verteilt mit Parameter Kappa0 01.06.2005

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Gewurzelter Baum, indem jeder Knoten einen Grad  3 besitzt. Beschreibt die Sekundärstruktur einer RNA-Sequenz 4 Arten von Knoten: 1. singlet: 2. paired: 3. loop: 4. stem: Struktur wird vom Auftreten von Loop- und Stem-Knoten bestimmt unabhängig evolvierende Nukleotide kovariante Basenpaare Anfang einer Loopsequenz Anfang einer Stemsequenz 01.06.2005

Knotenbeschriftungen: = { L, S } = { A, C, G, U } ² = { AA, AC, AG, AU, CA, CC, CG, CU, GA, GC, GG, GU, UA, UG, UC, UU } 01.06.2005

R1(X, S) = R1(S,X) = 0 für alle X element Omega 01.06.2005

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Implementierung der Grammatik-Parser setzt eine Umgestaltung der Grammatik voraus. Problemstellen: Null-Zykel - können durch Loop-/Stemlängen = 0 entstehen Silent Bulges - S  S Loop Bifurcation - L LL 01.06.2005

Null-Zykel (4, 7, 11) Loop Bifurcation (24, 27) Silent Bulge (32, 29, 30) 01.06.2005

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Komplexität der Algorithmen: single sequence SCFG: Zeit: (L³) Platz: (L²) pairwise SCFG: Zeit: (L³M³) Platz: (L²M²) => Finden des wahrscheinlichsten Parse-Baums mit Hilfe des CYK-Algorithmus 01.06.2005

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Implementierung eines Alignment-Tool auf Basis der SCFG‘s Basierend auf dynamischen Programmieren mit beschleunigenden Heuristiken Als Test der Leistungsfähigkeit des Modells werden Paare von RNA-Sequenzen miteinander aligniert und deren Struktur vorhergesagt. 4 verschiedene Familien mit variierender Homologie im Bereich der Sekundärstruktur wurden ausgewählt. 01.06.2005

summiert über alle Alignments mit der anderen Sequenz Alignment mit dem TKF91-Structure Tree Strukturvorhersage für einzelne Sequenz Strukturvorhersage summiert über alle Alignments mit der anderen Sequenz Alignment mit dem TKF91-Modell 01.06.2005

Identische Sekundärstruktur Primärsequenz weicht voneinander ab Purine Riboswitch Identische Sekundärstruktur Primärsequenz weicht voneinander ab 01.06.2005

Regulatorische Elemente die spezifisch Adenin oder Guanin binden. Sind Bestandteil der post-translationalen Regulation von Purin-Transport und –biosynthese. 01.06.2005

Nano translational control element Deletion des äußeren Stems 01.06.2005

Regulatorische Sequenz im 3‘ UTR der nano-Gene von Drosophila. 01.06.2005

sehr ähnliche Primärsequenz U2 splicing factors Deletion von Stem 4, 5 und 6 sehr ähnliche Primärsequenz 01.06.2005

Bindet am Schneidepunkt zwischen Exon und Intron und markiert Schnittstelle in pre-mRNA‘s 01.06.2005

in der Sekundärstruktur variabelste Familie in RFAM RNase P Genes Starker Unterschied in der Sekundärstruktur variabelste Familie in RFAM 01.06.2005

Endoribonuklease Ribozym (katalytische Funktion) Spielt Rolle in der Biosynthes von tRNA‘s. 01.06.2005

StructureTree singlet RNA Sequenzen Strukturvorhersage StructureTree singlet StructureTree paired pairHMM Alignment pairSCFG Alignment Purine Riboswitches schlecht korrekt Nano translational control element gut Probleme in den Rand-bereichen wesentlich besser U2 splicing factors RNase P 01.06.2005

Gliederung Einführung Das TKF91 Modell Der TKF91 Structure Tree Vorstellung der durchgeführten Tests Interpretation der Ergebnisse 01.06.2005

streng konservierte Struktur und wenige InDels führen zu guter Stärken des Modells: streng konservierte Struktur und wenige InDels führen zu guter Struktur-Vorhersage und Alignment Bei vielen InDels in Loops und Stems oder bei geringfügigen Änderungen der Sekundärstruktur arbeitet der StructureTree auch gut Schwächen des Modells: Ab einem bestimmten Grad der strukturellen Unterschiede zwischen Sequenzen versagt das Modell (RNase P) 01.06.2005

Mögliche Verbesserungen: Hinzunahme von „long indels“ und affiner Gap-Penalty zusätzliche Modellierung von Thermodynamik-Effekten (Basepair Stacking, Nearst Neighbour Interaktion) Verbessertes Einfügen von Bulges (Zulassen von L-Knoten in Stems) Annahme das Stems und Loops alle mit der gleichen Rate evolvieren ist empirisch nicht belegt Triloops, Tetraloops, U-Turns u.ä. werden nicht speziell behandelt, obwohl oft evolutionär konserviert Einführung spezieller InDel-Raten für Stems/MultiStems (bislang gleiche Raten) Verbesserung der Stem-Deletion, äußer Stems sollten nicht zwangsläufig zu Löschung von inneren führen. Belegt durch empirische Studien in RFAM. 01.06.2005

A probabilistic model for the evolution of RNA structure – Holmes RNA secondary structure prediction with simple pseudoknots – Deogun, Donis, Komina, Ma 01.06.2005

Gliederung Einleitung Algorithmus von Akutsu Nearest Neighbour Thermodynamik Regeln Berechnung minimaler Energien von RNA-Substrukturen Optimale Energie eines Pseudoknots Analyse des Algorithmus 01.06.2005

In diesem Algorithmus werden nur einfache Pseudoknoten betrachtet. Wie bereits gesehen, ist die Pseudoknoten-Vorhersage kein triviales Problem. Die Möglichkeit zur Vorhersage ist aber wichtig, da Pseudoknoten verbreitete Strukturen sind, die eine wichtige Rolle in funktionell wichtiger RNA spielen. In diesem Algorithmus werden nur einfache Pseudoknoten betrachtet. Algorithmus wurde entwickelt, um Sequenzen mit Länge >100 betrachten zu können. Laufzeitverbesserung im Gegensatz zu Eddy/Rivas: ER = (n6) Zeit, (n4) Platz  DK = (n4) Zeit, (n3) Platz 01.06.2005

zur Vorhersage von Pseudoknots Nearest Neighbour Thermodynamik Regeln mfold-Algorithmus Neuer Algorithmus zur Vorhersage von Pseudoknots Akutsu-Algorithmus zur Vorhersage von Pseudoknots unter Maximierung von Basenpaaren 01.06.2005

Eine Sekundärstruktur S einer RNA-Sequenz A = a1a2…an ist eine Definition: Eine Sekundärstruktur S einer RNA-Sequenz A = a1a2…an ist eine Menge von Basenpaaren. Ein Basenpaar zwischen ai und aj ( i < j ) wird notiert als ( i – j ) M = { (i  j) | 1  i < j  n, (ai  aj) ist Basenpaar und jedes i und j taucht max 1 mal auf } 01.06.2005

Eine Menge von Basenpaaren wird RNA-Sekundärstruktur ohne Pseudoknoten genannt, wenn folgende Bedingung erfüllt ist: Es existieren keine Basenpaare (ai  aj), (ah  ak) M, die i  h  j  k erfüllen. Skizze: i…..h…..j…..k 01.06.2005

Eine Menge von Basenpaaren wird RNA-Sekundärstruktur mit Pseudoknoten genannt, wenn folgende Bedingung erfüllt ist: Es existieren Positionen j‘ und j‘‘ für I < j‘ < j‘‘ < K, so dass für jedes Paar (i  j)  MI,K gilt: I  i < j‘ < j < j‘‘ oder j‘ < i < j‘‘ j  K 01.06.2005

Gliederung Einleitung Algorithmus von Akutsu Nearest Neighbour Thermodynamik Regeln Berechnung minimaler Energien von RNA-Substrukturen Optimale Energie eines Pseudoknots Analyse des Algorithmus 01.06.2005

Der Algorithmus von Akutsu bewertet RNA-Strukturen anhand der Anzahl ihrer Basenpaare. Idee: Basenpaarungen tragen zu einer erhöhten Ordnung im Molekül bei und erniedrigen dadurch die freie Energie der Struktur. Strukturen mit hoher Anzahl Basenpaaren werden daher in der Natur bevorzugt und durch den Algorithmus besser bewertet. 01.06.2005

Zur Berechnung des optimalen Pseudoknots werden 4 Matrizen benötigt: SL(i, j, k) enthält Score des besten Foldings zwischen I und i, und j und k. Unter der Bedingung das i mit j paart. SR(i, j ,k) enthält Score des besten Foldings zwischen I und i, und j und k. Unter der Bedingung das j mit k paart. SM(i, j, k) enthält Score des besten Foldings zwischen I und i, und j und k. Unter der Bedingung das weder i mit j, noch j mit k paart. PS(i, j) enthält Score des besten Pseudoknot mit Anfangspunkt i und Endpunkt j 01.06.2005

Um einen Pseudoknot mit Anfangspunkt I und Endpunkt K zu finden, muss der Algorithmus drei Typen von Triplets berechnen: SL(i, j, k), SR(i, j, k) und SM(i, j, k) für jedes i, j, k für das gilt (I  i < j < k  K) Berechnung von SL(i, j, k): 01.06.2005

Berechnung von SR(i, j, k): Berechnung von SM(i, j, k): 01.06.2005

Optimaler Score für jedes Paar (i, j) kann durch folgende Rekursion Für jedes Paar (I, K), wobei I < K, werden die SL, SM und SR Matrizen berechnet. Optimaler Score für jedes Paar (i, j) kann durch folgende Rekursion berechnet werden: 01.06.2005

Gliederung Einleitung Algorithmus von Akutsu Nearest Neighbour Thermodynamik Regeln Berechnung minimaler Energien von RNA-Substrukturen Optimale Energie eines Pseudoknots Analyse des Algorithmus 01.06.2005

Die Nearest Neighbour Energy Rules sind weit verbreitet in der RNA Sekundärstrukturvorhersage. Problem ist so definiert: Berechnung von RNA-Strukturen mit minimaler freier Energie (-G) 01.06.2005

Es existiert keine systematische Studie über die Thermodynamik Problem: Es existiert keine systematische Studie über die Thermodynamik von Pseudoknots. In den Nearest Neighbour Energy Rules sind Pseudoknots „verboten“. Annahme: Freie Energie eines Pseudoknots ist die Summe der stabilisierenden Werte beider Stämme und die der destabilisierenden Loops. 01.06.2005

Gliederung Einleitung Algorithmus von Akutsu Nearest Neighbour Thermodynamik Regeln Berechnung minimaler Energien von RNA-Substrukturen Optimale Energie eines Pseudoknots Analyse des Algorithmus 01.06.2005

Zur Berechnung der minimalen Energie von RNA-Substrukturen werden 3 N x N Matrizen benötigt: 1. V(i,j) enthält Score des besten Foldings zwischen i und j, unter der Bedingung das i und j paart. 2. W(i,j) enthält Score des besten Foldings zwischen i und j, egal ob i und j paaren oder nicht. 3. PS(i,j) enthält Score der besten Pseudoknot-Konfiguration zwischen den Positionen i und j. Für jedes RNA-Segment mit Start i und Ende j (i<j) 01.06.2005

V(i, j) =  , wenn i und j nicht paaren können 01.06.2005

Struktur in jedem Schritt ist. Algorithmus nimmt immer ein Nukleotid dazu und beobachtet, was die beste Struktur in jedem Schritt ist. Im letzten Schritt wird W(1, n) berechnet und enthält die minimale Energie der gesamten Sequenz. Über ein Traceback durch die Matrizen werden die Strukturen der Sequenz bestimmt. 01.06.2005

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Gliederung Einleitung Algorithmus von Akutsu Nearest Neighbour Thermodynamik Regeln Berechnung minimaler Energien von RNA-Substrukturen Optimale Energie eines Pseudoknots Analyse des Algorithmus 01.06.2005

Optimale Energie eines Pseudoknots Folgende Matrizen werden zur Berechnung benötigt: 1. SL(i, j, k) Enthält Score des besten Folding zwischen Positionen I und i, und j und k. Enthält Energie des Loops der von i und j geschlossen wird. Setzt Paarung von i und j vorraus. 2. SR(i, j, k) Enthält Score des besten Folding zwischen Positionen I und i, und j und k. Enthält Energie des Loops der von i und j+1 geschlossen wird. Setzt Paarung von j und k vorraus. 3. SM(i, j, k) Enthält Score des besten Folding zwischen Positionen I und i, geschlossen wird. Setzt vorraus, dass weder i mit j paart, noch j mit k. 01.06.2005

i mit j paart und in SM(i, j, k) falls i nicht mit j paart. 4. stem1(i, j) Enthält Energie von S1, die in SL(i, j, k) gespeichert ist, falls i mit j paart und in SM(i, j, k) falls i nicht mit j paart. 5. stem2(j, k) Enthält Energie von S2, die in SR(i, j, k) gespeichert ist, falls j mit k paart und in SM(i, j, k) falls j nicht mit k paart. stem1 und stem2 werden zur Berechnung von SL, SR und SM benötigt. stem1 und stem2 erhalten die Werte, die als minimale Energien für SL, SR oder SM gewählt wurden. stem1 und stem2 enthalten zusammen die Energie einer Struktur (i, j, k). 01.06.2005

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SL(i, j, k) = SR(i, j, k) = SM(i, j, k) =  für alle i, j, k außer: Initialisierung SL(i, j, k) = SR(i, j, k) = SM(i, j, k) =  für alle i, j, k außer: SL(i, k-1, k) = hairpin(i, k-1) + penalty wenn i und k-1 paaren können stem1(i, j) = hairpin(i, j) falls i und j paaren können stem1(i, j) =  sonst stem2(i, j) =  für alle i, j 01.06.2005

Berechnung der SL Matrix Wenn i und j paaren, kann der Wert in SL(i, j, k) auf drei Arten zustandekommen: Das Paar (i – j) schließt einen Hairpin Loop 2. Das Paar (i – j) stackt auf einem Paar (i-1 – j+1) 3. Das Paar (i – j) schließt zusammen mit einem Paar (ip – jp) einen Bulge oder einen Internal Loop 01.06.2005

SL(i, j, k) = min { E1, E2 } E1 = hairpin(i, j) + stem2(j+1, k) E2 = minIi, i+4 j<jp<k { hairpin(i,j) – hairpin(ip, jp) + loop(ip, jp, i, j) + SL(ip, jp, k) } 01.06.2005

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E1 = hairpin(i,j) + penalty Spezialfall: Ist stem2(j+1, k) =  (  Substruktur enthält nur einen Hairpin-Loop), dann folgt: E1 = hairpin(i,j) + penalty Paaren i und j nicht, werden SL(i, j, k) und stem1(i, j) wie folgt berechnet: 01.06.2005

Berechnung der SR Matrix Wenn j und k paaren, kann der Wert in SL(i, j, k) auf drei Arten zustandekommen: Das Paar (j – k) schließt einen Hairpin Loop 2. Das Paar (j – k) stackt auf einem Paar (j+1 – k-1) 3. Das Paar (j – k) schließt zusammen mit einem Paar (jp – kp) einen Bulge oder einen Internal Loop 01.06.2005

SR(i, j, k) = min { E3, E4 } E3 = hairpin(j, k) + stem1(i, j+1) E4 = minj<jp, jp+4kp<k { loop(j, k, jp, kp) + SL(i, jp, kp) } 01.06.2005

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E3 = hairpin(j, k) + penalty Spezialfall: Ist stem1(i, j+1) =  (  Substruktur enthält nur einen Hairpin-Loop), dann folgt: E3 = hairpin(j, k) + penalty Paaren j und k nicht, werden SR(i, j, k) und stem2(j, k) wie folgt berechnet: 01.06.2005

   Berechnung der SM Matrix In der SM Matrix geht man davon aus, dass weder i mit j, noch j mit k paaren, auch wenn sie dazu in der Lage wären.    Bei Fall 1.) stem1(i, j) = stem1(i-1, j) Bei Fall 2.) stem1(i, j) = stem1(i, j+1), stem2(j, k) = stem2(j+1, k) Bei Fall 3.) stem2(j, k)= stem2(j, k-1) 01.06.2005

Der Score eines Triplets hängt nur von I ab nicht von K. Komplexität: Für jedes Paar (I, K) müssen Scores für (n³) Triplets berechnet werden. Der Score eines Triplets hängt nur von I ab nicht von K. Es müssen (n³) Scores für jedes I berechnet werden  Zeit: (n4) Der Speicherplatzbedarf resultiert aus den NxNxN-Matrizen  Speicherplatz: (n³) 01.06.2005

Gliederung Einleitung Algorithmus von Akutsu Nearest Neighbour Thermodynamik Regeln Berechnung minimaler Energien von RNA-Substrukturen Optimale Energie eines Pseudoknots Analyse des Algorithmus 01.06.2005

Test mit einer Menge von simplen Pseudoknots aus PseudoBase Ergebnisse: Test mit einer Menge von simplen Pseudoknots aus PseudoBase 169 Sequenzen, mit einer Länge zwischen 19 und 114 Nukleotiden Algorithmus faltet 163 Pseudoknots und 6 einfache Strukturen 131/163 sind korrekt oder fast korrekt gefaltet worden Für 3 der 6 einfachen Strukturen kann die Vorhersage, durch Erhöhen der penalty verbessert werden Bei einer der simplen Strukturen ist im Pseudoknot der Datenbank ein A-G bp enthalten 01.06.2005

Vergleich mit dem Eddy/Rivas Programm: Deogun/Komina 50 % der Pseudoknots erkannt 95 % der Pseudoknots erkannt Davon 78 % mit korrekter oder fast-korrekter Struktur Berechnungszeiten: 75 Nukleotide  55 Sekunden 114 Nukleotide  8 Minuten 01.06.2005

Quellen: Akutsu (2000): Dynamic programming algorithm for RNA secondary structure prediction with pseudoknots, Discrete Apllied Mathematics Deogun, Komina et al. (2004): RNA Secondary Structure Prediction with Simple Pseudoknots, APBC2004 Holmes (2004): A probabilistic model for the evolution of RNA structure, BMC Bioinformatics Mattick (2005): Das verkannte Genom-Programm, Spektrum der Wissenschaft (März 05) Thorne, Kishino, Felsenstein (1991): An evolutionary model for maximum likelihood alignment of DNA sequences, J Mol Evol Zuker et al.: Algorithms and thermodynamics for RNA secondary structure prediction: A practical guide, NATO ASI Series 01.06.2005