Ke Feng2), Sven Schubert1) ATP hemmt die Plasmalemma-H+-ATPase in Wurzel und Blatt von Zea mays L. Xiaoqing Qian2), Xiaozhi Wang2), Yuhua Shan2), Stefan Hanstein1)*, Peter Friedhoff3), Ke Feng2), Sven Schubert1) 1) Institut für Pflanzenernährung, Heinrich-Buff-Ring 26, Justus-Liebig-Universität Giessen, 35392 Giessen 2) College of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University, Jiang Yang Zhong Lu 31, 225009 Yangzhou, P.R.China 3) Institut für Biochemie, Heinrich-Buff-Ring 58, Justus-Liebig-Universität Giessen, 35392 Giessen * korrespondierender Autor, e-mail: stefan.m.hanstein@ernaehrung.uni-giessen.de Einleitung Ergebnisse Mg bindet freies ATP mit hoher Affinität. Die ATP-Hemmung konnte durch Steigerung der Mg-Konzentration von 5 auf 15 mM aufgehoben werden. Dies entspricht Befun-den zur Na-K-ATPase8. Die Plasmalemma-H+-ATPase (P-ATPase) ist das Kraftwerk für die Nährstoffaufnahme der Pflanzenzelle1. Das Enzym wird durch Mg-ATP angetrieben2. Im Ruhezustand der Zelle ist die Aktivität des Enzyms durch mehrere Mechanismen mehr oder minder stark gedrosselt1,3. Hier demonstrieren wir, dass ATP als Hemmstoff fungiert, wenn es nicht durch Mg gebunden wird. Um die physiologische Relevanz der Hemmung abzuschätzen, wurden Hemmstoffkonstan-ten (Ki-Werte) errechnet. Plasmalemma-Vesikel aus der Wurzel in Gegenwart von 5 mM Magnesium zeigten eine Sättigung der Aktivität bereits ab 1 mM ATP (Abb. 1). Ein hemmender Einfluss der höchsten ATP-Konzentrationen ließ sich nicht ausschließen. Bei ATP-Konzentrationen bis 15 mM trat der hemmende Einfluss von ATP sowohl in der Wurzel (Abb. 2) als auch im Blatt (Abb. 3) klar zutage. Material & Methoden Zea mays L. cv. Pioneer wurde in drei Wiederholungen in Nährlösung in der Klimakammer angezogen (T=21°C/16°C, 16 h 500 µE m-2 s-1, 50% rF). Im 7-Blatt-Stadium wurden Plasmalemma-Vesikel aus jungen Wurzeln und jungen Blättern isoliert4. Die P-ATPase-Aktivität wurde anhand des freigesetzten Phosphats bestimmt4. ATP-Abnahme und ADP-Zunahme (ADP hemmt ATPasen) wurden durch ein ATP-regenerierendes System unterbunden. Als Bezugsgröße diente der Vesikelprotein-gehalt. Die Aktivität wurde als Aktivitäts-abnahme nach Vanadatzusatz (vanadat-sensitiv) oder bei kompletter Hemmung anderer ATPasen gemessen. Zur Bestimmung von Ki-Werten wurden mithilfe des Computerprogramms DynaFit5 nicht-lineare Regressionsanalysen durch-geführt, da sie eine Verzerrung der experi-mentellen Streuung vermeiden6. Dabei wurden die Dissoziationskonstanten für Metall-ATP-Komplexe berücksichtigt7. Abb. 5: ATP-Spaltung bei einer Mg-Konzentration von 5 mM ( ) und 15 mM ( ). K-Konzentration 150 mM. Kein ATP-regenerierendes System. Wenn die Konzentration von ATP die des Mg übersteigt, kommt sowohl freies ATP als auch K-ATP als Hemmstoff in Betracht. Mithilfe von DynaFit5 wurden für beide Fälle und für verschiedene Hemm-Mechanismen Km und Ki berechnet (Tab. 1). Abb. 2: Hemmung der ATP-Spaltung in der Wurzel bei ATP-Konzentrationen oberhalb der Mg-Kon-zentration. K-Konzentration 150 mM. n = 3, Daten normalisiert. Grüne Regression mit Kd-Werten für Metall-ATP-Komplexe aus der Literatur, rot: Regression ohne Berücksichtigung von K-ATP. Tab. 1: Km und Ki im Blatt bei Annahme von ver-schiedenen Hemm-Mechanismen: kompetitiv: kom., unkompetitiv: unko., nicht-kompetitiv: nicht. Die DynaFit-Analyse ergab auch, dass jeder der Mechanismen gleich gut die experi-mentellen Befunde erklären kann. Aufgrund der Ähnlichkeit der Hemmstoffe zum Substrat (Mg-ATP) ist eine kompetitive Hemmung am naheliegendsten9. Schlussfolgerungen Abb. 3: Hemmung der ATP-Spaltung im Blatt bei ATP-Konzentrationen oberhalb der Mg-Konzen-tration. K-Konzentration 150 mM. n = 3, Daten normalisiert. Substanzen, die Mg komplexieren, fördern die hemmende ATP-Wirkung. Substanzen, die einen ATP-Überschuss komplexieren, können die ATPase stimu-lieren. Auch wenn statt Na2-ATP ein metallfreies ATP (BisTris-ATP) verwendet wurde, nahm die Aktivität ab. Literatur 1 Palmgren MG. 2001. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52: 817-845. 2 Vara F, Serrano R. 1982. J. Biol. Chem. 257: 12826-12830. 3 Buch-Pedersen MJ, Rudashevskaya EL, Berner TS, Venema K, Palmgren MG. 2006. J. Biol. Chem. 281: 38282-38292. 4 Yan F, Feuerle R, Schäffer S, Fortmeier H, Schubert S. 1998. Plant Physiol. 117: 311-319. 5 Kuzmic, P. 1996. Anal. Biochem. 237: 260-273. 6 Kleber H-P, Schlee D, Schöpp W.. 1995. Jena: Gustav Fischer: 177-183. 7 Smith RM, Martell AE, Chen Y. 1991. Pure Appl. Chem. 63: 1015-1080. 8 Robinson JD. 1974. Biochim. Biophys. Acta 341: 232-247. 9 Jenkins WJ. 1994. Arch. Biochem. Biophys. 313: 89-95. Abb. 1: Vanadat-sensitive ATP-Spaltung durch Plasmalemma-Vesikel aus der Wurzel bei verschiedenen ATP-Konzentrationen. Die Kalium-Konzentration betrug 50 mM. n = 3, Mittelwerte und Standardabweichungen. Abb. 4: Wirkung von ATP-Formen mit Natrium ( ) und ohne Natrium ( ) auf die Rate der ATP-Spaltung.