Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Tag 5 Auswertung von schnellen Kinetiken Aufgabe 15: Auswertung einer schnellen Kinetik mit Exponentialfunktionen Einführung in Methoden der Fehlerabschätzung Aufgabe 16: Quantitative Fehlerabschätzung Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Warum pre-steady-state Kinetiken (“schnelle Kinetiken”)? E ES ES‘ ES‘‘ .... ES# EP E+P +S -S „ES“ Steady-state Phase: Die Konzentrationen aller Intermediate sind konstant. Alle Intermediate können formal zu einem Intermediat zusammengefasst werden. Man kann keine Informationen über Konformationsänderungen des Enzym-Substrat Komplex gewinnen. Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Warum pre-steady-state Kinetiken (“schnelle Kinetiken”)? E ES ES‘ ES‘‘ .... ES# EP E+P +S -S Um Enzymmechanismen zu verstehen, muss man die Annäherung an den steady-state und die Verteilung der verschiedenen Konformationen im steady-state untersuchen. Wie schnell entstehen ES, ES‘, ES‘‘ etc. ? Wieviel ES, ES‘, ES‘‘ etc. ist im steady-state vorhanden ? Diese Änderungen laufen im Bereich von msec ab! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Kinetik von Mehrstufenreaktionen E+S ES EP E+P v = kobs * [E] * [S] k1k2k3 k-1k-2+k-1k3+k2k3 v = [E] * [S] Aus steady state Messungen ist k2 schwer extrahierbar! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Aber aus pre-steady state Messungen! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Wie kann man “schnelle Kinetiken” messen? „stopped-flow“ Motor Spritze B Spritze A Küvette Misch-kammer Lampe F-Detektor „quenched-flow“ Auffangen und Analysieren Spritze mit Stopplösung Reaktions-raum Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Auswertung schneller Kinetiken Stopped-flow und quenched-flow Kinetiken können allgemein als Summe von Exponentialfunktionen beschrieben werden allgemein: Relaxationszeit Signal Baseline mit Steigung Summe von Exponentialfunktionen Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Auswertung schneller Kinetiken A+B AB AB‘ ... A + C k1 k-1 k2 k-2 k3 k-3 kn k-n Anzahl der Exponentialterme (n) gibt minimale Anzahl der Gleichgewichtssysteme an Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Auswertung schneller Kinetiken Relaxationszeiten hängen von kinetischen Konstanten ab AB  A + B Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Einführung in die Fehleranalytik Farbe = Rot Durchmesser = 1,1224516 cm Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Einführung in die Fehleranalytik: Korrelation von Parametern vmax vmax Fehler in der Anpassung des kcat bedingen zwangsläufig Fehler beim Km (und umgekehrt): Die Parameter sind korreliert! Km Km c(Substrat) Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Einführung in die Fehleranalytik Sinnvolle Fehlerabschätzungen gehören zu den schwierigeren Aufgaben im wissenschaftlichen Alltagsbetrieb. Typische Fragestellungen sind: Wie zuverlässig sind meine Daten? Wie genau sind die berechneten Konstanten? Kann ich bestimmte Modelle ausschließen? Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Einführung in die Fehleranalytik Methoden zur Fehlerabschätzung: Statistische Analyse von Mehrfachmessungen Analyse der Genauigkeit einzelner Messungen Analyse der Form der Fehlerfläche … Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Statistische Analyse von Mehrfachmessungen Identische Experimente werden wiederholt (oder ganze experimentelle Serien, wenn man zur Auswertung mehr als einen Datensatz braucht) und dann unabhängig voneinander ausgewertet. Anhand der Ergebnisse lassen Sie die Schwankungsbreiten der einzelnen Parameter leicht angeben (Standardabweichung, maximale Abweichung etc.). Gute Methode, aber aufwendig! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Analyse der Genauigkeit einzelner Messungen Einzelne Punkte werden aus der Anpassung herausgenommen. Damit “simuliert” man, was man auswerten würde, wenn man dieses eine Experiment nicht gemacht hätte. Bei solchen Varianten erhält man eine gute qualitative Einschätzung der Zuverlässigkeit der Daten, insbesondere, ob das Ergebnis stark von einzelnen Punkten abhängt. Eine solche Analyse sollte ein Routinebestandteil jeder Auswertung jedes Experimentes sein. Gute Methode, um Unsicherheit der Datenanalyse aufzudecken. Experimentelle Fehler werden nicht erfaßt! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Analyse der Form der Fehlerfläche Semiquantitative Methode bei Auswertungen mit vielen verschiedenen Parametern. Man definiert eine maximale, sinnvolle Abweichung der FQS oder der absoluten Fehler. Dann minimiert und maximiert man systematisch alle Parameter unter Variation aller anderen mit der Nebenbedingung FQS<max. Abweichung. Bei solchen Varianten erhält man eine gute Einschätzung der unterschiedlichen Genauigkeit verschiedener Variablen. Gute Methode, um Unsicherheit der Datenanalyse in komplexen Auswertungen aufzudecken. Experimentelle Fehler werden nicht erfaßt! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Analyse der Form der Fehlerfläche Minimum der FQS Fehlerbereich des Experiments Variationsbreite Y-Werte Variationsbreite X-Werte Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Analyse der Form der Fehlerfläche Parameter 1 Parameter 2 Parameter 3 ..... FQS Anpassung Fehleranalyse Parameter 1 Parameter 2 Parameter 3 ..... FQS < Grenze Parameter 1 Parameter 2 Parameter 3 ..... FQS < Grenze Parameter 1 Parameter 2 Parameter 3 ..... FQS < Grenze Parameter 1 Parameter 2 Parameter 3 ..... FQS < Grenze xxx = variieren = minimieren = maximieren etc. Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Tag 5 Auswertung von schnellen Kinetiken Aufgabe 15: Auswertung einer schnellen Kinetik mit Exponentialfunktionen Einführung in Methoden der Fehlerabschätzung Aufgabe 16: Quantitative Fehlerabschätzung Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente