Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins
Gliederung Allgemeines Motivation für die genaue Erforschung des Bewegungsablaufes Aufgaben der Kinesin- und Myosin V-Moleküle Kinesin Myosin V Vergleich und Zusammenfassung
Allgemeines Wandeln chemische in mechanische Energie um Viel filigraner als herkömmliche Schrittmotoren Messen nur wenige Nanometer Kann das Tausendfache seines Gewichtes transportieren
Motivation Anwendungen im Nanobereich Goldman: "What concerned me was how this little myosin motor can move along the track without letting go and floating off into the cytoplasm of the cell"
Aufgaben in der Zelle Kinesin: Transport von Makromolkülen und kleiner Oranellen in der Zelle Myosin V: Transportiert verschie- dene Substanzen innerhalb von Nerven- zellen
Struktur von Kinesin Kopf: Motor Stiel: Doppelwendel Schwanz: kann Last binden
Kinesin Bewegt sich entlang einer Mikrotubuli
Bewegungsmechanismus bei Kinesin Aufnahme von ATP ATP-Hydralisation Pi-Abgabe ADP-Abgabe Erneute ATP-Aufnahme
Struktur von Myosin V Kopf: Motorbereich Genick: Lichtkette Schwanz: kann Last binden
Myosin V Bewegt sich entlang eines Actinfilaments
Schrittweite des Myosin V Genaue Bestimmung der Schrittweite: Früher: Bestimmungen mit festem Actinfilament Jetzt: Rotationsfreiheit des Actinfilaments
Versuchsaufbau Actinfilament auf zwei Kügelchen Aufsetzen der Doppelkugel mit dem Myosin V-Molekül mit optischer Pinzette Ausschalten der Laserfalle
Mögliche Bewegungsformen Schrittweite ca. 36nm: Rechts- oder linkshändige Spirale um Actinfilament mit großer Ganghöhe Kleine Schrittweite: starke rechtshändige Rotation (wie RNA um DNA) Entlanggleiten an den Strängen
Bewegung bei maximaler Geschwindigkeit
ATP- konzentrationsunabhängig Nicht alle Moleküle zeigten Rotation: Linkshändige Spirale 2 Umdrehungen über 4.4mm ATP- konzentrationsunabhängig Nicht alle Moleküle zeigten Rotation: Gründe: Zurück gelegter Weg zu kurz ( < 2mm) Zu kurzes Actinfilament Rotation durch 'Schutt' verhindert
Diagramm
Schrittweite Linkshändige Rotation: Schrittweite etwas kleiner als 36nm Rechtshändige Rotation: Schrittweite kleiner als 18nm Schrittweite zwischen 18nm und 36 nm
Berechnung der Schrittweite Mittlere Schrittweite: 34,8nm 36nm*(2.200nm-72nm)/(2.200nm) = 34,8nm Mittlerer Drehwinkel pro Schritt: 6°
Schrittweite ist konstant Unabhängig von ATP-Konzentration Last unabhängig Realisation: 104 Myosin V Moleküle an einem Doppelkügelchen
Zwei mögliche Bewegungsformen Hand-over-hand: Beide Köpfe sind abwechselnd führend Inchworm: Ein Kopf ist immer vorn der andere immer hinten
Hand-over-hand – Inchworm
Voraussagen der beiden Modelle Hand-over-hand: Abwechselnd Schritte der Weite (37 G 2x)nm Inchworm: Immer gleich große Schritte der Schritt- weite 37nm
Auflösungsvermögen Lokalisation: G6nm bei einer Zeitauflösung von 20s (scanning confocal microscopy) Ortsauflösung: 2nm bei Objekten der Größe 30 – 150nm bei einer Zeitauflösung von 30ms
Einzel-Molekül-Fluoreszenz Lokalisation von 1.5nm in 2d Zeitauflösung von 0.5s Photostabilität von bis zu einigen Minuten Fluorescence imaging with one- nanometer accuracy: FIONA
FIONA Lokalisation: Gaußfit in 2d Photostabilität: Sauerstoffreinigungssystem
Test: FIONA Probe an ruhender DNA Bewegung des Spots in definierten Schritten und definierter Verweilzeit Ergebnis: Genauigkeit der Ortsbestimmung: 1.3nm
FIONA mit Mysion V Mysion V mit Rohdamin versehen: 50 000 bis 100 000 Photonen pro Spot Lokalisation: G3nm, helle Spots sogar G1.5nm 49 verschiedene Moleküle 552 ganze Schritte
Beobachtete Schrittweiten gleichgroße Schritte mit einer Schrittweite von 74nm Alternierend zwei verschieden große Schrittweiten: 52nm und 23nm 42nm und 33nm
52-23nm und 42-33nm Schritte
74nm Schritte
74-0nm Schritte Zwischen zwei 74nm-Schritten ein 0nm-Schritt versteckt Kinetische Überlegungen: bei gleicher ATP-Konzentration halb so große Schrittrate wie bei 52-23- oder 42-33-Schritten: Experiment: Schrittrate (52-23/42-33): 0.35 s-1 Schrittrate (74-0): 0.17s-1
Ergebnis Myosin V bewegt sich nach dem Hand-over-hand Modell Mittlere Schrittweite: (74 + 0, 52 + 23, 42 + 33)/2 nm = 37nm
Vergleich und Zusammenfassung Myosin V: Actinfilament Hand-over-hand Schrittweite von 34.8nm Kinesin: Microtubuli 8nm Schrittweite