Massenspektrometrie – eine Einführung H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie

Wozu dient die Massenspektrometrie? Mir ihrer Hilfe kann man die Masse von Atomen und Molekülen bestimmen. In einem Bereich von 1Da..>100kDa Mit einer Massengenauigkeit von bis zu 1ppm Von Probenmengen im Bereich < 10-6 .. 10-15g Über Fragmentierungen erhält man Strukturhinweise Mir ihrer Hilfe kann man die Menge von Verbindungen bestimmen. Durch die Massenselektivität gelingt das auch in Gegenwart von Beimengungen (mit anderer Masse). Von Mengen im Bereich < 10-6 .. 10-15g

Was sind die Voraussetzungen für eine MS-Messung? Die Moleküle müssen vereinzelt, d.h. von ihresgleichen und von allen anderen abgetrennt werden. Wechselwirkungen würden die Massenbestimmung stören. Die Moleküle müssen ionisiert werden. Die Ladung dient als „Griff“ um Kräfte auf das Molekül auszuüben. Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor

Kopplung eines Gaschromatographen mit einem Massenspektrometer – GC-MS Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Verdampfen der Probe ins Hochvakuum – Direkteinlass, Tiegeleinlass, direct inlet, „Schubstange“ Kopplung eines Gaschromatographen mit einem Massenspektrometer – GC-MS MS GC

Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum +• Ins Vakuum einschleusen + Verdampfen Ionisieren Radikalkationen EI

positive Spannung für positive Ionen Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Elektronenionisation* - EI 10-5..10-7mBar positive Spannung für positive Ionen 0V Turbomolekularpumpe * Die veraltete Bezeichnung ist Elektronenstossionisation

Elektronenionisation* - EI Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Elektronenionisation* - EI Bei der (EI) wird die Substanz im Hochvakuum mit 70eV Elektronen beschossen. Der größte Teil der Energie wird nicht auf das Molekül übertragen. Lediglich 6-10eV dienen zur Ionisation nach dem Schema: M + e-  M+. + 2e- Darüber hinaus werden noch 2-10eV Energie (sog. Überschußenergie) auf das Molekül übertragen. Das führt zur Anregung des Moleküls und zur Fragmentierung. Ein EI-Spektrum ist die Auftragung der Häufigkeit der im Zeitraum von 10-8 s gebildeten Ionen gegen ihren m/z Wert (bei z=1 entspricht das der Masse).

Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Quadrupolanalysator (Quadrupolmassenfilter) Quadrupolstäbe Wechselspannung m/z zu klein Detektor Ioneneintritt Ionenbahnen m/z passend m/z zu gross

Substanzeinlass Ionenquelle Analysator Detektor Sekundärelektronenvervielfacher SEV, secondary electron multiplier SEM Elektronen Ionen V 100V Hoher Verstärkungsfaktor >106 geringes Eigenrauschen, schnell.

Das erste Ergebnis jeder Messung ist ein „Rohspektrum“ Die Peakhöhe wird auf den intensivsten Peak (100%) normiert. Die x-Achse ist eine m/z Skala! Die Peaks haben eine Breite, die von der instrumentellen Massenauflösung abhängt. Die angezeigten Massenwerte stellen die Schwerpunkte oder die Maximalwerte der Rohdatenpeaks dar. Oft werden die Rohdaten in ein Strichspektrum umgerechnet. Hier kann es zu Rundungs- problemen kommen

Isotopie und Atomgewichte alle Angaben in Dalton (Da) 35Cl 75,7% 79Br 50,7% 81Br 49,3% 1H 99.998% 37Cl 24,3% 13C 1,1% 2H 0.015% Kohlenstoff Chlor Brom Wasserstoff Das stöchiometrische Atomgewicht (average mass) ist das gewichtete Mittel der Isotopeneinzelgewichte 12,011 35,46 79,9 1,0079 Auch die Massen der reinen Isotope sind nicht ganzzahlig (Ausnahme 12C) 12,00000 34,9683 78,91779 1,0078 13,00281 2,0141 36,96535 80,91574

Schrittweiser Aufbau des Isotopenclusters von C6H4BrCl Molekülionen sind meist eine Gruppe von Peaks, sie entsteht durch die Kombination der natürlichen Isotopen der beteiligten Elemente. Schrittweiser Aufbau des Isotopenclusters von C6H4BrCl C6 72 73 C6H4 76 77 C6H4Br 155 157 158 C6H4BrCl 190 192 194

Molekulargewichtsdefinitionen (nach IUPAC) Das stöchiometrisches Molekulargewicht (average mass) ist die Summe der Atomgewichte. Darin sind die mit ihrer Häufigkeit gewichteten Isotope in ihrer natürlichen Verteilung enthalten. Das nominale Molekulargewicht ist die Summe der gerundeten Isotopenmassen (der häufigsten Isotope). Das „monoisotopische Ion“ ist die Kombination der häufigsten Isotope. Es ist nicht notwendigerweise der intensivste Peak eines Isotopenclusters. Eine Massenangabe wird als „exakte Masse“ bezeichnet, wenn sie mit einer Präzision von +-5ppm (oder +-5mDa) bestimmt oder berechnet wurde. Beispiel C6H4BrCl average 191.459 nominal 190 nominal 192 exakte Massen 191.91499 12C61H437Cl79Br 191.91590 12C61H435Cl81Br monoistopisch 189.9179 bei nicht ausreichender Auflösung wird der Summenpeak mit m/z 191.9156 gefunden

Hochauflösung Befinden sich auf der gleichen Nominalmasse zwei oder mehr Ionen verschiedener Elementarzusammensetzung, so muß die Auflösung des Massenspektrometers besonders erhöht werden, um diese unabhängig voneinander bestimmen zu können. Bei Werten von R10%Tal > 10.000 spricht man von Hochauflösung. Unregistered 284 283 282 281 280 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 C19H36O C20H40 m/z 280.31300 281.31645 282.31993 m/z 280.27661 281.28003 282.28319 Massenunterschied 0,037Da notwendige Auflösung 280/0,037= 7500

EI-Spektrum - Interpretationsansatz .CH3 CO C2H4 HCl CH3CO+ C3H7+ Skyline wohldefinierte Bruchstellen Molekülion m/z 154/155/156/157 Isotopenmuster enthält 1 Chloratom Fragmentierungen M-15, M-15-28, M-15-28-36 charakteristische Ionen m/z 38/39; 50..52; 62..65; 74..78 Alle EI-Beispielspektren sind der NIST Datensammlung entnommen

Was bestimmt den Zerfall von angeregten Radikalkationen? Bildung stabiler Kationen Abspaltung günstiger (=stabiler) Radikale Abspaltung stabiler (kleiner) Neutralteilchen

Beispiel 1 m/z 101 α-Spaltung m/z 86 m/z 58 m/z 30

Stickstoffsregel Doppelbindungsregel Ist das Molekülion geradzahlig, so enthält das Molekül eine gerade Anzahl von N-Atomen (oder keine). Ist das Molekülion ungeradzahlig enthält es eine ungerade Zahl von N-Atomen Doppelbindungsregel nC, nH, nN = Anzahl der Atome Die Zahl der Doppelbindungen und/oder Ringe lässt sich folgendermassen berechnen: Wenn Stickstoff anwesend ist, muss das berücksichtigt werden:

Beispiel 2 m/z 142 m/z 71 m/z 57 Keine Abspaltungen von CH2 sondern von Ethen, Propen, Buten usw. m/z 29

Beispiel 3 m/z 134 m/z 91 McLafferty Umlagerung m/z 92

Beispiel 4 McLafferty Umlagerung: das ML-Ion beinhaltet die Alkoholseite und die Position 2 des Esters. Substitution an diesen Positionen verschiebt das Produktion. m/z 74

Beispiel 5 Diese Verbindung enthält nur 1 Heteroatom.

Massenspektrometrie – eine Einführung Beispiel 6 EI-Spektrum 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 50 31 43 69 77 85 111 125 139 147 165 182 m/z Molekulargewicht m/z 182 Skyline wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 Auffällige Isotopenmuster bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.

Massenspektrometrie – eine Einführung Beispiel 6 DBE = ((2*Zahl der C-Atome + 2)-Zahl der H-Atome)/2 Cl zählt als einbindiges Atom wie ein H. EI-Spektrum 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 50 31 43 69 77 85 111 125 139 147 165 182 m/z Molekulargewicht m/z 182 Skyline wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 Auffällige Isotopenmuster bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten. Summenformel C8H19ClO2 C9 H7 Cl O2 C10H11ClO C11H15Cl „übersättigt“ maximal wäre H17 6 Doppelbindungsäquivalente 5 Doppelbindungsäquivalente 4 Doppelbindungsäquivalente

Massenspektrometrie – eine Einführung Beispiel 6 EI-Spektrum 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 50 31 43 69 77 85 111 125 139 147 165 182 m/z Molekulargewicht m/z 182 Skyline wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 Auffällige Isotopenmuster bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten. Summenformel C9 H7 Cl O2 6 DBE - C10H11ClO - 5 DBE - C11H15Cl 4 DBE Schlüsselion m/z 77 Phenylring CO oder C2H4 mögliche Partialstruktur C3H7 oder C2H3O

Massenspektrometrie – eine Einführung Beispiel 6 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 50 31 43 69 77 85 111 125 139 147 165 182 EI-Spektrum m/z bei diesen Strukturen erwartet man einen [M-CH3]+ Peak bei m/z 167 einige Strukturmöglichkeiten (Substitutionsmuster am Aromaten unberücksichtigt)

Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum +• Ins Vakuum einschleusen + Verdampfen Ionisieren Radikalkationen EI Laserbeschuss + Ins Vakuum einschleusen Matrixpräparation Kationen MALDI

+ LDI und MALDI Target mit 16x24 = 384 Probenpositionen Man kann Verbindungen durch einen intensiven Laserpuls verdampfen und ionisieren. Diese Laser-Desorption-Ionisation mit einem N2Laser erfordert eine Bestrahlungsstärke von ca. 5MW/cm2 . Empfindliche, polare und grosse Moleküle werden bestenfalls als Fragmente detektiert. Um Fragmentierungen zu verhindern, wird die Probe mit einem grossen Überschuss einer Matrixsubstanz gemischt und auf der Probenfläche cokristallisiert. Dieses Gemisch liefert bereits bei 0.5 MW/cm2 Bestrahlungsstärke intakte Ionen. Es wird als Matrix-Assistierte Laser-Desorption-Ionisation bezeichenet Die universellste Matrix ist 2,5-Dihydroxybenzoesäure, sie wurde von F. Hillenkamp und M. Karas eingeführt.

+ MALDI Bei der MALDI werden im Gegensatz zur Elektronenstoßionisation keine Radikalkationen erzeugt, sondern es entstehen meist* Ionen mit gerader Elektronenzahl. positiv negativ Weil der gefundene m/z Wert nicht gleich dem Molekulargewicht ist, spricht man von Pseudomolekularionen. Die Überschußenergie ist wesentlich geringer, s.d. man überwiegend intakte Pseudomolekularionen beobachtet. Die Ionisation ist hervorragend für große Moleküle geeignet (Peptide, Proteine DNA, RNA Fragmente, Oligomere) *Bei Matrices mit Elektronenübertragung (z.B. DCTB) enstehen Radikalkationen oder/und Radikalanionen.

MALDI + Spektrum einer basischen Verbindung C30H43NO2 MW 449.3 Als Matrix wurde 2,5-Dihyroxybenzoesäure verwendet. Unter günstigen Umständen (wie diesen) sieht man nur den Pseudomolekularpeak der Probe.

Flugzeitmassenspektrometer – „time of flight“ TOF Idealer Analysator bei pulsweiser Ionenproduktion wie sie bei MALDI und LDI vorliegt Laserimpuls Flugrohr (Länge l) Detektor Gitter auf 0V t Intensität t Intensität Probe auf Hochspannung (U) ca. 20kV e U = ½ m v2 sqrt(2eU/m) = v = s/t e = Elementarladung U = Beschleunigungsspannung m = Masse eines Moleküls s = Länge des Flugrohrs t = Flugzeit

+ MALDI Spektrum eines Oligomeres – Ionenbildung durch Na+ Anlagerungen Abstand 44 Da Matrixionen Masse der repetierenden Einheit 44Da Vorschlag 481.2 - 10* 44.03 - 23 = 18 Masse der Endgruppen = 18Da Polyethylenglycol

Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum +• Ins Vakuum einschleusen + Verdampfen Ionisieren Radikalkationen EI Laserbeschuss + Ins Vakuum einschleusen Matrixpräparation Kationen MALDI + Probe gelöst, Ionenbildung! Versprühen im E-Feld Transfer zum Vakuum Kationen ESI

Welche Pseudomolekularionen können bei ESI beobachtet werden? Positivmodus [M+H]+ [M+NH4]+ [M+Na]+ [M+K]+ [M+2H]2+ [M+2Na]2+ Bei Gemischen auch Heterodimere Bei sehr leicht oxidablen Verbindungen [M-e]+ [M+H+Na]2+ [2M+H]+ [2M+NH4]+ usw. Negativmodus Bildung von Dimeren etc wie im Positivmodus [M-H]- [M+Cl]- [M+HCOO]-

Kontaktierung (0.6-2kV) Kapillare mit 10ul Probenlösung ES(I) 1cm Kontaktierung (0.6-2kV) Kapillare mit 10ul Probenlösung Sehr feine Spitze Nanosprayeinlass Geöffnete Sprühkammer Ioneneintritt zum MS N2 Strom zur Desolvatation ESI aus einer Stahl- kapillare (Schleifeneinlass, HPLC)

HPLC-MS Kopplung HPLC-Pumpe Injektionsventil ESI-MS Autosampler Trennsäule

ES(I) – Electrosprayionisation + (M+H)+ 2-Amino-3-methylbutanol K+ Auch bei sehr empfindlichen Verbindungen keine Fragmentierung zum Vergleich das EI-Spektrum kein Molekülpeak sichtbar dafür Strukturinformation durch die Fragmentierung!

Um welches Polymer könnte es sich handeln? Die beobachteten Ionen sind NH4+-Anlagerungen. Abstand betrachten 74.0188 Isotopenpeaks beachten C2 H6 O Si

Grosse Moleküle unter ESI-Bedingungen Beispiel Cytochrom C 10+ 11+ 12+ 9+ 8+ 7+ 13+ 14+ 15+ Δm/z = 1/15 = 0.0666

Normal(scan)betrieb eines „Triplequads“ MS-MS Experiment –Daughter ions Normal(scan)betrieb eines „Triplequads“ Ionenquelle Quadrupol 1 Quadrupol 2 Stosskammer Detektor Ionenquelle Quadrupol 1 Quadrupol 2 Stosskammer Detektor Tochterionenmodus Nur ein m/z Fragmentierung

Gegenüberstellung EI ESI

Musteranalyse 1 Flüssigkeit leicht löslich in Methanol ESI Zugabe von NH4OAc MW 162 Gerade Zahl von N Nicht basisch

Musteranalyse 1 Mögliche Summenformeln für m/z 163 bei einer Genauigkeit von +- 0.3 Da Nur C,H,O zugelassen. Tochterionenspektrum von m/z 180 -46 -44 180-NH3 Anwesenheit von Heteroatmen

Musteranalyse 1 Messung der exakten Massen Damit ist die Summenformel der neutralen Verbindung als C8H18O3 bestimmt Sie enthält keine Doppelbindungen oder Ringe Im Tochterionenspektrum war kein H2O Verlust sichtbar. Vermutlich handelt es sich um einen Ether.

Musteranalyse 1 -C2H6O = Ethanol -C2H4O Tochterionenspektrum mit exakter Massenbestimmung -C2H6O = Ethanol -C2H4O symmetrisch?

Musteranalyse 1 GC-MS-EI

Musteranalyse 1 EI Spektrum z.B. mit GC Einlass Spektrensuche in der NIST-Datenbank (200000 Spektren) Vergleichsdarstellung mit dem besten Treffer MW 162

Musteranalyse 2 Wasser/Methanol-lösliche Substanz enthält eine aromatische Carbonsäure (als Ester) enthält einen (?) Zuckerrest enthält Quercetin (en Flavonoid) trägt am Ring Substituenten Methode ESI oder HPLC-ESI-MS C6H12O6 oder C5H10O5 C28 H25 O16 DBE 16.5 Abweichung -0.101mDa

Musteranalyse 2 MS-MS (Tochterionen) HCD trägt am Ring Substituenten C6H12O6 oder C5H10O5 Die Gallussäure und der Zucker müssen miteinander verbunden sein

Musteranalyse 2 2 Alterantiven MS-MS (Tochterionen) CID Das Quercetin und der Zucker müssen miteinander verbunden sein. Es gibt kein Ion in dem Quercetin zusammen mit dem Galloylrest vorkommt

Schema eines oTof Massenspektrometers

What‘s new in the MS-group? LTQ-Orbitrap XL (ETD)

Complete Scheme Demo Orbitrap

LTQ Orbitrap™ Hybrid Mass Spectrometer Finnigan LTQ™ Linear Ion Trap API Ion source Linear Ion Trap C-Trap Orbitrap Differential pumping Differential pumping Inventor: Dr. Alexander Makarov, Thermo Electron (Bremen) Die Folien zur Orbitrap stammen aus einer Demonstration der Fa. Thermo Fisher Scientific

LTQ Orbitrap Operation Principle 1. Ions are stored in the Linear Trap 2. …. are axially ejected 3. …. and trapped in the C-trap 4. …. they are squeezed into a small cloud and injected into the Orbitrap 5. …. where they are electrostatically trapped, while rotating around the central electrode and performing axial oscillation The oscillating ions induce an image current into the two outer halves of the orbitrap, which can be detected using a differential amplifier Ions of only one mass generate a sine wave signal

Frequencies and Masses The axial oscillation frequency follows the formula Where w = oscillation frequency k = instrumental constant m/z = …. well, we have seen this before Many ions in the Orbitrap generate a complex signal whose frequencies are determined using a Fourier Transformation

The Orbitrap

Trajectories in the orbitrap Characteristic frequencies: Frequency of rotation ωφ Frequency of radial oscillations ωr Frequency of axial oscillations ωz r z φ

Effect of resolution: example North Sea Oil „Gull Faks“ Nanospray positive Resolutions: unit res. 7500 30000 100000