Sicherheitsunterweisung für das mikrobiologisch-molekularbiologische Praktikum am Gymnasium Wir geben Ihnen einige Tipps und Tricks, mit denen Sie nicht nur sicherer, sondern auch effektiver experimentieren werden. Diese Präsentation ist gewissenhaft erstellt worden. Für eine juristisch genaue Darstellung kann jedoch keine Haftung übernommen werden.

Allgemeines Die Experimente werden Ihnen Spaß machen. Sie üben sich in wissenschaftlicher Arbeit. Halten Sie sich exakt an die Anweisungen für die Experimente.

Formale Aspekte Diese Unterweisung ist gesetzlich vorgeschrieben Sie bestätigen diese Unterweisung durch Ihre Unterschrift am Praktikum dürfen nur unterwiesene Praktikanten teilnehmen, die die Betriebsanleitung gelesen haben

Sicherheitseinrichtungen Fluchtwege und Sammelstelle Erste-Hilfe Kästen Feuerlöscher Betriebsanweisungen Alarmplan Es sollte eine Sammelstelle vereinbart/bekannt sein, wo sich alle Schüler bei einer Notevakuierung ihres Praktikums treffen. Dies ist wichtig, um die Vollzähligkeit überprüfen zu können. Wenn jemand fehlen sollte, so muss eine gezielte Suchaktion nach der vermissten Person eingeleitet werden.

Persönliche Schutzmaßnahmen Laborkittel und eventuell Handschuhe und Schutzbrille tragen Straßenkleidung außerhalb des Labors aufhängen Keine Schreibunterlagen auf die Arbeitsflächen legen Handschuhe und Schutzbrille sind nur bei bestimmten Tätigkeiten vorzusehen. Z.B. sollten Handschuhe bei Arbeiten mit Ethidiumbromid oder anderen Nukleinsäurefarbstoffen getragen werden. Temperaturstabile Handschuhe beim Entladen des Autoklaven. Schutzbrille: Abfüllen von starken Säuren, Laugen etc. Trennen von Straßenkleidung/Laborkittel verhindert den unbeabsichtigten Transport von Bakterien aus dem Praktikumsraum. Eine völlig unkontrollierte Verbreitung von Bakterien kann stattfinden, wenn die Schreibunterlagen mit Bakteriensuspensionen auf der Arbeitsfläche in Kontakt kommen.

Persönliche Schutzmaßnahmen Hände waschen und Sterilium nutzen vor dem Verlassen des Labors und vor Nutzung der Toilette Allergien (z.B. gegen Aldehyde) dem Lehrer melden Im Praktikum nicht essen, trinken, rauchen, Kaugummi kauen, etc Arbeitsanweisungen befolgen Bakterien-Anreicherungen sind grundsätzlich als pathogen anzusehen Sterilium und andere Desinfektionsmittel enthalten häufig einen beträchtlichen Anteil verschiedner Aldehyde Bakterien-Anreicherungen sollten nur unter genau definierten Bedingungen durchgeführt werden, bei denen strenge Selektionskriterien nur apathogene Keime zur Entwicklung kommen lassen.

Gefahrenquellen eine Auswahl Autoklav Bunsenbrenner Chemikalien: leicht entzündbare Lösungen (Ethanol, etc.) Gase Glasgeräte Zentrifugen Spritzen und Kanülen Einige nicht identifizierte Bakterien Aerosolbildung bei pipettieren, zentrifugieren,... Hier sind die „typischen“ Gefahrenquellen gelistet, die mit ungeübten Praktikanten zu beachten sind Autoklav: wenn ´flüssiges Autoklaviergut nicht weit genug abgekühlt ist (<60-70°C), so können Siederverzüge auftreten Chemikalien: z.B. Ethidiumbromid, Polyacrylamid, flüssiger Stickstoff, Trockeneis, Glasgeräte: wegen Bruchgefahr. Die Bruchstellen sind meist scharfkantig. Eine Wunde, verursacht durch Glasbruch, sollte von einem Arzt untersucht werden, der die Entfernung aller Glassplitter bestätigt. Zentrifugen: hohe physikalische Belastung der Zentrifugenbecher durch hohe Erdbeschleunigungen (mehrere tausend g) Sptzen: Stichverletzungen Unter Bakterien werden solche verstanden, die als „S2-Organismen“ oder S3/S4 Organismen bekannt sind. Solche Keime sind pathogen Aerosolbildung: kleinste Flüssigkeitströpfchen, die nicht unbedingt gesehen werden, aber genügend Bakterien enthalten können. Aerosole entstehen immer dann, wenn Flüssigkeiten mit hoher kinetischer Energie auf Oberflächen treffen

Alarmplan Ruhe bewahren Lehrer informieren Gegebenenfalls Notarzt / Krankentransport rufen Schulleiter benachrichtigen Hat ihre Schule einen Alarmplan für kritische Situationen? Ist dieser Plan ausgedruckt verfügbar?

Maßnahmen bei Verbrennungen und Verbrühungen Brennende Person ablöschen (Feuerlöschdecke, CO2-Feuerlöscher) Bekleidung/heiße Stoffe entfernen Betroffene Körperteile mit kaltem Wasser behandeln Brandwunden keimfrei bedecken Wärmeverlust verhindern

Allgemeine Hinweise Nur auf glatten, desinfizierbaren Oberflächen arbeiten Keine Chemikalien oder lebensfähige Bakterien ins Abwasser geben Chemikalien dosiert abwiegen, nicht in Vorratsgefäße zurückgeben! Abfälle sortieren und in Behältern sammeln Wasserverbrauch reduzieren Oberflächen: es sollte nach Möglichkeit auf offenporiges Holz im Laborbereich vollkommen verzichtet werden Sind z.B. Stuhlflächen aus Holz, so sollten sie gestrichen sein

Feuerlöscher Vor Benutzung den Sicherungsstift ziehen Kann nur für wenige Sekunden genutzt werden Nur CO2-Feuerlöscher zum Ablöschen von Personen verwenden! Brände von unten und mit der Brandrichtung bekämpfen Pulverlöscher dürfen nicht für Personenbrände verwendet werden

Autoklaven dürfen nur nach Einweisung durch einen Lehrer bedient werden keine Gefäße autoklavieren, die mehr als zur Hälfte mit Flüssigkeiten gefüllt sind Autoklavierband nutzen Leere, geschlossene Gefäße mit etwas Wasser befüllen beachte chemische Reaktionen, Siedepunkte, Ausdehnung von Gasen etc, die während des Autoklavierens eine Druckerhöhung erwarten lassen Autoklav muss zum öffnen auf 60-70°C abgekühlt sein: Siedeverzug! Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe tragen Autoklaveninnenraum notfalls reinigen und Wasser wechseln Regelmäßige Kontrolle der Wirksamkeit: Sporentest Autoklaven im Schulbereich sollten nur durch Lehrer oder besonders befähigte SchülerInnen bedient werden. Autoklavierband und Sporenteste können u.a. bezogen werden von: „3M Comply Indicator Tape“ (Roth 8221) und Bacillus stearothermophilus Sporensuspension: „Sterikon plus Bioindikator“ (vwr Bestell-Nr.: 1.10274) Die Wirksamkeit der Sterilisation wird durch Luft drastisch reduziert. Daher den Gas/Wasserdampf austausch ermöglichen: z.B. nach Möglichkeit keine verschlossenen Gefäße autoklavieren Wenige Wassertropfen im leeren Gefäß ermöglichen eine Wasserdampfatmosphäre, die für eine Sterilisation bei 121°C notwendig ist Der Bediener ist für den ordnungsgemäßen Betrieb zuständig. Unregelmäßigkeiten müssen sofort abgestellt werden.

Autoklav Bedingungen: 121°C, 20 min, 1 bar Wasserdampf-überdruck Autoklavierzeit ist ab-hängig von der Flüssig-keitsmenge im Sterilgut Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe tragen Kontrolle durch Autoklavierband Luft behindert den Temperaturübergang ins Sterilgut Wasserdampf erleichtert den Temperaturübergang Je größer das Flüssigkeitsvolumen ist, desto länger muss die Autoklavierzeit gewählt werden Wählen Sie die Autoklavierzeit so kurz wie möglich, weil unter den hohen Temperaturen chemische Reaktionen ablaufen, die z.T. zu unerwünschten Produkten führen (siehe auch farbliche Veränderungen in Medien). Das Autoklavierband enthält temperaturempfindliche Bariumsalze, die sich über 115°C verfärben Entladen des Autoklaven nur mit festen Handschuhen (z.B aus einem Baumarkt) Gefahrenquelle: Verbrühungen nach Siedeverzügen, Verbrennungen durch heiße Gefäße

Laborkittel hochgeschlossener Kittel verdeckte Knopfleiste zugeknöpft am Ende des Praktikums als Kochwäsche reinigen Achten Sie bei der Anschaffung neuer Laborkittel auf die „verdeckte“ Knopfleiste: Es sollte nur kochwäschestabiles Material verwendet werden. Dadurch wird ein zusätzlicher Schutz der Kleidung vor Kontaminationen gewährleistet. Der Laborkittel sollte nicht mit der Straßenkleidung in Berührung kommen, um ein Verschleppen von Bakterien zu verhindern

Abfallgefäße Nach Möglichkeit aus autoklavierbaren Plastikbechern Festsubstanzen im Autoklavierbeutel sammeln Kanülen in einem speziellen Kanülenentsorgungs-behälter sammeln Richten Sie gegebenenfalls mehrere Abfallgefäße ein: Festabfälle, Flüssigabfälle, und eventuell für Objektträger und Kanülen (Kanülen nur in speziellem Kanülenentsorgungsbehälter sammeln, z.B. von: vwr, Bestell-Nr. 119F.4261) Füllen Sie das Gefäß für die Flüssigkeitsabfälle maximal bis zur Hälfte des Gesamtvolumens! Autoklavierbeutel im Festabfall vor dem Autoklavieren nicht zuschnüren: behindert den Wasserdampfaustausch und damit die Sterilisier-Effizienz Achten Sie darauf, dass die Gefäße entsprechend beschriftet sind! Diese Beschriftungen sind nicht unbedingt stabil während des Autoklavierens.

Abfallgefäße Flüssigsubstanzen in verschliessbaren Glasflaschen mit etwas Desinfektionsmittel sammeln. Diese Gefäße maximal bis zur Hälfte des Volumens füllen. Richten Sie gegebenenfalls mehrere Abfallgefäße ein: Festabfälle, Flüssigabfälle, und eventuell für Objektträger und Kanülen (Kanülen nur in speziellem Kanülenentsorgungsbehälter sammeln, z.B. von: vwr, Bestell-Nr. 119F.4261) Füllen Sie das Gefäß für die Flüssigkeitsabfälle maximal bis zur Hälfte des Gesamtvolumens! Autoklavierbeutel im Festabfall vor dem Autoklavieren nicht zuschnüren: behindert den Wasserdampfaustausch und damit die Sterilisier-Effizienz Achten Sie darauf, dass die Gefäße entsprechend beschriftet sind! Diese Beschriftungen sind nicht unbedingt stabil während des Autoklavierens.

Kulturgefäße Erlenmeyer mit Schikanen Kulturröhrchen Agarplatte achten Sie auf eine vollständige Beschriftung Hier werden die gebräuchlichsten Gefäße für ein mikrobiologisches Praktikum vorgestellt. Die Beschriftung sollte umfassen: Bakterien, Stamm, Datum, Namenkürzel des Experimentators, experimentelle Besonderheit (z.B. Antibiotikum) Achten Sie darauf, dass die Kulturgefäße für aerobe Organismen nur relativ wenig Medium bei möglichst großer Oberfläche enthalten. Dadurch wird die Durchmischung/Belüftung wesentlich verbessert. Die Schikanen stellen Flächen dar, an denen sich das schüttelnde Medium bricht und so Sauerstoff aufnehmen kann. Die Kulturröhrchen werden im Inkubator in einem möglichst flachen Winkel geschüttelt, um die Oberfläche möglichst groß zu machen.

Agarplatten Dienen der Vereinzelung von Bakterienzellen Einzelzellen bilden Kolonien = Klone Die Oberflächen sollen trocken sein 1. Agarplatten haben

Agarplatte Nur am Boden beschriften Kopfüber inkubieren Mehrere Agarplatten stapeln und eventuell mit Testband sichern Bei mehrtägigen Inkubationen in einer Feuchten-Kammer inkubieren Der Deckel kann ausgetauscht werden; daher niemals am Deckel beschriften Wenn die Agarplatten kopfüber inkubiert werden, dann kann sich auch der Oberfläche kein Wasser bilden. Lagern Sie frische Agarplatten in Folien eingepackt im Kühlschrank. Die Folie verhindert das Austrocknen im Kühlschrank

Agarplatten: empfohlene Beschriftungen Oben: Beschriftung entlang des Bodens Unten: Beschriftung entlang des Randes Tipp: wird auf den Deckel geschrieben, so der dieser ausgetauscht/vertauscht werden 2. Wird auf die gesamte Bodenfläche geschrieben, so stört das die spätere Auswertung

Stammsammlungen Organisieren Sie Ihre Stammsammlung Sie bietet Ihnen Referenzorgansimen Lagerung bei mindestens -20°C in 10%-igem sterilen Glycerin Legen Sie jeweils eine getrennte Datenbank über Ihre Organismen und Enzyme mit folgenden Datenfeldern an: Name, Herkunft (z.B. DSMZ mit deren Nummer), Züchtungs-Medium, Plasmid, Antibiotika-Resistenz, Verwendung (Experimente), weitere Stamm-Charakteristika, Monat und Jahr der Anlage Glycerin stabilisiert die Zellen (u.a. Gefrierschutzmittel) das Einfrieren erniedrigt die freie Wasserkonzentration (aW-Wert). Je tiefer die Temperatur, desto geringer das freie Wasser, desto geringer die biologische Aktivität Nur kurz aus dem Kühlschrank entnehmen, nicht auftauen lassen! Das Inokulum kann durch Einstechen eines sterilen Zahnstochers entnommen werden Bezugsquelle für Referenzstämme: DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), Mascheroder Weg, Braunschweig

Datenbank zur Stammsammlung Datenfelder Eintrag Stamm E. coli DSMZ 3424 Medium LB-Medium Box/Gefäß-Nr 1/5-10 Lager-Datum 4.2002 Plasmid pUC18 Antibiotika-Resistenz Amp Verwendung Plasmidisolierung

Gesehen in einem Mikrobiologie-Labor .... Nicht mit Filzschreiber beschriften, da die Schrift durch Färbelösungen abgewaschen werden kann Objektträger nicht mit Finger anfassen, sondern mit einer Flach-Pinzette

Impföse Die Platinöse rotglühend abflammen Den Metallteil des Kollehalters nur kurz durch die Flamme ziehen Nicht senkrecht über die Flamme halten Die Platinöse sollte vor dem Aufnehmen einer Kolonie auf Agarplatte an einem nicht bewachsenen Teil abgekühlt werden. Fassen Sie die Öse weit hinten am Kolle-Halter an; setzten sie die Platinöse zum Ausstreichen nur mit ihrem Eigengewicht auf. Damit verhindern Sie auf Aufritzen der Agaroberfläche („pflügen“) Anstelle der Platinöse kann auch notfalls eine Eisenöse genutzt werden. Eisen wird allerdings sehr schnell oxidiert, wodurch die Öse „abrostet“

Die Bunsenbrennerflamme Der obere, orange gefärbte Flammenteil ist der „heiße“, oxidierende Teil Der untere, blau gefärbte Flammenteil ist der „kalte“, reduzierende Teil Nur auf feuerfester Unterlage benutzen Zum ausglühen der Ösen bringen Sie diese erst in den unteren, reduzierenden Flammenteil. Dann ziehen Sie die Öse in den oxidierenden Teil Beachten Sie, dass beim Hineinhalten der Öse in die Flamme Kulturflüssigkeit verspritzen und die Umgebung kontaminieren kann.

Überimpfen Kulturgefäße nur so kurz wie möglich öffnen Öffnen nur in der Nähe einer Bunsenbrennerflamme (wegen aufsteigender Luft!) Öffnung des Gefäßes nach Möglichkeit abflammen Die Thermik verhindert nach unten gerichtet Luftströme, die zur Kontamination der Kulturen führen kann Abflammen des Kulturgefäßes nur bei hitzstabilen Materialien (Glasgefäße). Es bildet sich ein Flüssigkeitsfilme erleichtern das Wachstum und die Ausbreitung von Kontaminationen

Drigalski-Spatel mit 80%-igem Ethanol benetzen Kurz abflammen! Vor Gebrauch auf unbeimpfter Agaroberfläche auskühlen lassen So lange auf der Agaroberfläche reiben, bis der Widerstand merklich größer wird Die Agaroberfläche sollte angetrocknet sein (nie frisch gegossene Agarplatten verwenden) Es werden bis zu 100 µl (in Ausnahmefällen bis zu 200 µl) Suspension auf die Agaroberfläche aufgetragen und mit dem Drigalski-Spatel eingerieben. Anfangs ist der Reibwiderstand durch den Flüssigkeitsfilm („Aquaplaning“) gering. Wenn die Flüssigkeit in die Agar-Oberfläche eingerieben ist, wird der Reibwiderstand merklich größer Flüssigkeitsfilme müssen vermieden werden, weil Bakterien darin wachsen und so keine Einzelkolonie entstehen kann

Hygieneplan Was Wann Womit Hände Nach der Arbeit Sterilium Fußboden Nach Verschütten von Bakterienlösung Korsolin Arbeitsflächen Vor/nach dem Experiment 80% Ethanol Geräte Bei Bedarf Laborkittel Am Ende des Praktikums Kochwäsche Einwegmaterial, Bakterien-suspensionen Am Endes des Experimentes Autoklav: 121°C, 20 min Gibt eine kurz gefasste Übersicht; Ersetzt nicht den vorgeschriebenen, vollständigen Hygieneplan

Desinfektion Labortische und sonstige Oberflächen mit 80%-igem Ethanol einsprühen Achtung: Bunsenbrenner aus: Brandgefahr! Achtung: Schalten Sie den Bunsenbrenner aus, bevor Sie die Arbeitsfläche mit dem Alkohol aus aus dem Zerstäuber bespritzen Die Arbeitsflächen sollte zu Beginn und am Ende des Experimentes desinfiziert werden Der Alkohol enthält in der Regel ein Vergällungsmittel. Halten Sie Abstand, arbeiten Sie mit gestrecktem Arm, um möglichst wenig Alkohol-Aerosole einzuatmen

Pipette Präzisionsinstrumente: Nicht fallen lassen Regelmäßig ihre Richtigkeit überprüfen! Spitzen mit der Abwurfvorrichtung (2. und 3.) abwerfen Farbkode (1.) für die Spitzen beachten Flüssigkeiten im Schaft (4.) sofort entfernen! Pipetten beim Nichtgebrauch im Ständer aufbewahren! Pflegen Sie ihre Pipetten nach Angaben des Herstellers: es handelt sich um Präzisionsinstrumente, deren Funktionszuverlässigkeit wesentlich zu ihrem experimentellen Erfolg beitragen ! Zur Überprüfung der Richtigkeit kann mehrfach hintereinander ein definiertes Volumen Wasser auf die Analysenwaage pipettiert werden Pipettieren kann Aerosole (kleinste Flüssigkeitstropfen) verursachen: je heftiger Sie die Lösung auspressen, desto mehr Aerosol wird gebildet. Aerosol kann Bakterien enthalten, die auf diesem Weg unkontrolliert in die Umwelt kommen Wenn Flüssigkeiten in den Pipettenschaft aufgesaugt wurde, so muss diese sofort gereinigt und desinfiziert werden

Pipettierhilfe Niemals mit dem Mund pipettieren Immer Pipettierhilfe benutzen Auf „Auslauf“ pipettieren Pipettieren Sie z.B. 4 ml mit einer 5ml-Pipette, so wird die Pipette bis zur „0-ml-Marke“ gefüllt und die Flüssigkeit dann bis auf die „4-ml-Marke“ auslaufen gelassen

Glaspipette Pipetten mit der Spitze nach oben in den Pipettenklo geben Sterilisieren: Trockenschrank, 180°C, 30 min Wenn Sie häufiger mit Glaspipetten arbeiten, dann sollten Sie auf dem Arbeitsplatz einen größeren Plastikbecher mit Wasser und Detergenzlösung (Haushaltsspülmittel) aus Zwischenlager aufstellen. Autoklavieren der Glaspipetten in Alu-Dosen Die thermischen Belastungen beim Trockensterilisieren beeinflussen die Genauigkeit Ihrer Pipetten negativ.

Handhabung der Glaspipetten Glaspipetten sollten bei Nichtgebrauch auf einer Pipettenunterlage aufbewahrt werden. Bitte niemals auf den Labortisch legen! Der Auslauf der Glaspipetten kann auf Laborflächen leicht abbrechen!

Zentrifuge Achten Sie auf austarierte Rotoren In einer Tischzentrifuge kann die 13 000-fache Erdbeschleunigung auf den Gefäßen anliegen Ausgetretene Flüssigkeiten sofort aus der Zetrifuge entfernen Tipps: Halten Sie für jede Zentrifuge einen Satz mit Reaktionsgefäße bereit, die mit unterschiedlichen Volumina Wasser gefüllt sind: von 100 bis 2000 µl in jeweils 100µl-Schritten Wenn Sie die Eppendorfgefäße immer so in den Rotor stellen, dass ihre Deckel-Laschen nach außen zeigen (siehe rote Pfeile im Bild), dann wissen Sie bei „unsichtbaren“ Niederschlägen (Pellets), wo sich nach der Zentrifugation ihre Probe befindet. „Unsichtbare“ Niederschläge bekommen Sie z.B. häufig bei der Isolierung von Nukleinsäuren. „ungewohnte“ Geräusche während des Zentrifugierens haben in der Regel diese Ursachen: (I.) Deckel auf dem Rotor vergessen oder (II.) der Rotor wurde nicht austariert.

Umgang mit Chemikalien Gefährlichkeit: ätzend, mutagen, .... Persönliche Schutzmaßnahmen: Beachten Sie die Handflaschen-Beschriftungen Sicherheitsdatenblätter beachten Laborkittel, Schutzbrille, Staubmaske, Handschuhe 3. Entsorgung nichts in den Abguss geben! Sammeln in den aufgestellten Sammelgefäßen Sammelbehälter für die verschiedenen Chemikalien aufstellen Stäube belasten die Atemwege; sie treten z.B. bei einigen Trockensubstanzen der Medien auf

Waage Wägeplatz sauber halten Chemikalien auf gefaltetem Papier abwiegen Keine Chemikalien in den Vorrat zurückgeben Als Papier empfiehlt sich „Drachenpapier“ aus einem Spielzeuggeschäft oder vergleichbare Papier mit beschichteter Oberfläche gefaltetes Papier hilft beim sicheren Überführen des Wägegutes in Gefäße mit engen Öffnungen

Beschriftung von Handflaschen Übernehmen Sie die Angaben vom Hersteller Bringen Sie gegebenenfalls die zwei wichtigsten Gefahrensymbole an Vermerken Sie alle R- und S-Sätze 70% Tipps: Bei Mischungen sollten die Gefahrensymbole der zwei wichtigsten Verbindungen berücksichtigt werden Sind bei dieser Chemikalie besondere Gesundheitsgefahren zu befürchten? Welche Erste-Hilfe Maßnahme muss bei einem Unfall mit dieser Chemikalie eingeleitet werden?

Schutzmaßnahmen bei Gefahrstoffen Persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille, Handschuhe) Info-Quellen nutzen: Sicherheitsdatenblätter und Betriebsanweisungen lesen Aerosolbildung vermeiden: Vorsicht beim Pipettieren, Zentrifugieren, etc. Nichts mit dem Mund pipettieren Sollte eventuell ausgelassen werden

... und jetzt die Unterschrift bitte Ich bestätige durch meine Unterschrift, an der Sicherheitsunterweisung zum mikrobiologisch-molekularbiologischem Praktikum teilgenommen zu haben, die sich an die Betriebsanleitung anlehnt. Ich habe die Betriebsanleitung gelesen; ich hatte die Möglichkeit Fragen zu stellen; ich habe die Ausführungen verstanden und ich werde mich an die Anweisungen halten. Die Sicherheitsunterweisung fand am ..... von .... bis .... statt. Der Projektleiter ........................... Vorschlag für den Kopf einer Unterschriftenliste zur Sicherheitsunterweisung als Anhang sollte der Inhalt in Stichworten wiedergegeben werden. Dabei sollte erwähnt werden, die „Betriebsanweisung situationsgerecht“ besprochen zu haben Name Unterschrift