Lipid rafts und ihre Funktion in biologischen Membranen Seminar Biotechnologie 1 Lisa Marie Finkler SS 2012 Betreuer: Prof. Dr. I. Bernhardt

Gliederung Biologische Membranen Lipid Rafts Ergebnisdarstellung Aufbau Membranlipide Membranproteine Funktionen einer biologischen Membran Fluid Mosaic Modell Lipid Rafts Funktionen von Lipid Rafts Ergebnisdarstellung „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“ “Ca++-dependent viscle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin”

Biologische Membranen Grenze zwischen 2 Kompartimenten Intrazellulär (innerhalb einer Zelle) Interzellulär (Inneren einer Zelle zu Zellaußenraum) Selektiv permeabel Bestehen hauptsächlich aus: Lipiden Anteil ist je nach Membrantyp Proteinen unterschiedlich

Aufbau einer biologischen Membran [1]

Aufbau einer biologischen Membran Membranlipide bilden die Grundstruktur (Doppelschicht) Amphiphatisch Hydrophiler Kopf Lipophiler Kohlenwasserstoffrest Permeabilitätsschranke Phospholipide Sphingolipide Cholesterin Mizelle Lipiddoppelschicht Liposom [2]

Aufbau einer biologischen Membran Phospholipide Phosphatidylcholin (siehe Abbildung) Phosphatidylserin Phosphatidylethanolamin Phosphatidylinositol häufigste Membranlipide [3]

Aufbau einer biologischen Membran Sphingolipide „Signalübertragung, Interaktion zwischen einzelnen Zellen, Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Zelltod“ [6] [4]

Aufbau einer biologischen Membran Cholesterin Steroid-Grundgerüst Hydrophiler Anteil (OH-Gruppe)  Membranoberfläche Hydrophober Rest  Innerhalb der Membran Gehalt an Cholesterin beeinflusst die Fluidität der Membran [5]

Aufbau einer biologischen Membran [6]

Aufbau einer biologischen Membran Integrale Membranproteine Amphiphatisch Hydrophober Anteil innerhalb der Membran Verankerung durch Wechselwirkung mit Fettsäureketten Hydrophiler Anteil außerhalb der Membran Wechselwirkungen mit der Umgebung Periphere Membranproteine Nichtkovalente Bindungen an Membran bzw. Proteine Lipidverankerte Proteine Kovalente Bindung an ein Lipid (z.B.: GPI-Verankerung)

Funktionen einer biologischen Membran Kompartimierung Selektive Permeabilität Transportvorgänge Signalaufnahme, Weiterleitung, Abgabe Ort der Energie- sowie Stoffumwandlung (Träger von Enzymen)

Fluid Mosaic Modell 1972 S.J. Singer und G.L. Nicolson Modell zum Aufbau der biologischen Membran Flüssig-kristalline Lipiddoppelschicht (Hydrophile „Köpfe“ der Membranlipide  außen, Hydrophobe „Fettsäureschwänze“  innen) Membranproteine inselartig eingelagert, lateral frei beweglich dynamische Struktur [7]

Fluid Mosaic Modell Membranfluidität Lipidzusammensetzung Cholesterinanteil (hoher Anteil  erhöhte Viskosität) Temperatur Stabilität durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Fettsäureketten Wärmezufuhr: Übergang von kristallinem zu flüssig-kristallinem Zustand [8]

„Lipid Rafts“- Lipidflöße [9]

„Lipid Rafts“- Lipidflöße Unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung von anderen Membranbereichen Sphingolipide Cholesterin Glycolipide GPI-verankerte Proteine Stärker geordnet und dichter gepackt Caveolae Ausbuchtungen der Membran Caveolin als wichtigste Strukturelement hochdynamische Strukturen Zusammenlagerung Auflösung

Funktionen von Lipid Rafts [8]

Funktionen von Lipid Rafts [9]

Ergebnisdarstellung „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“ von Ulrich Salzer, Rainer Prohaska; blood (2001 97:1141-1143) Erkenntnisse über die Zusammensetzung von Lipid Rafts Verwendete Methoden Isolation der Lipid Rafts aus Erythrozyten durch Extraktion Gelektrophorese, Silberfärbung Membranmarker: Acetylcholinesterase (AChE) Western Blot

Ergebnisdarstellung A: diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation (Spur 1: Pellet, Spur 2: hohe Dichte, Spur 3: mittlere Dichte, Spur 4: Lipid Rafts) B: Extraktion in alkalische Lösung (Na2CO3) (Spur T: Suspension vor Extraktion, Spur S: Überstand, Spur P: Pellet) Stomatin, Flotillin-1 und -2  Integrale lipid raft assoziierte Membranproteine Protein 4.1 und 4.2, Spectrin, Actin  Periphere Membranproteine Methode A Methode B

Ergebnisdarstellung Immunblot der isolierten Lipid Rafts Oligomere Komplexbildung von Flotillin-1 und -2 sowie Stomatin Spur 1 und 2: Erythrozytenmembran eines OHSt krankem Patienten; Spur N: gesunde Person Stomatin ist nicht in Spur 1 und 2 nachweisbar (OHSt) OHSt: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis

Ergebnisdarstellung “Ca++-dependent vesicle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin” von Ulrich Salzer, Peter Hinterdorfer, Ursula Hunger, Cordula Borken, Rainer Prohaska; blood (2002 99: 2569-2577) Erkenntnisse über die Bestandteile von Lipid Rafts sowie über die calciumabhängige Vesikulation Verwendete Methoden Rasterkraftmikroskopie Calciumabhängie Vesikulation Trennung der Mikro- und Nanovesikel durch Zentrifugation Gelektrophorese, Silberfärbung Western Blot

Ergebnisdarstellung Methode A und B unterscheiden sich Zentrifugationsmethoden A) Spur 1: Erythrozytenmembran Spur 2: Mikrovesikel Spur 3: Nanovesikel B) Spur 1: Erythrozytenmembran Spur 2 und 3: Mikrovesikel Spur 4: Nanovesikel Stomatin in Mikrovesikel Synexin und Sorcin in Nanovesikel Carboanhydrase ( CA) und Hämoglobin (Hb) in beiden nachweisbar

Ergebnisdarstellung A sowie B: Auswirkung von Ca2+ bzw. EDTA-Zugabe S: Überstand; P: Pellet nach Zentrifugation aq: aquatisch; dt: detergent nach Phasenseperation Synexin und Sorcin nach Ca2+ Zugabe im Pellet, nach EDTA Zugabe im Überstand Stomatin: keine Auswirkungen Stomatin nach Phasenseperation durch Triton X-114 nur noch in der detergenten Phase

Ergebnisdarstellung Periphere Membranproteine Durch hydrophobe Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen an Membran gebunden Ablösen durch Veränderung des pH-Wertes, des Puffers, der Salzkonzentration (EDTA) Integrale Membranproteine Ablösen durch Detergenz (Triton X-114) Stomatin Integrales Membranprotein, Cytoskelettanker beteiligt am Kationentransport (Na+/K+) Abwesenheit: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis Synexin Peripheres, calciumbindendes Protein Exozytoseprozesse, Membranfusion Sorcin Peripheres, calciumbindendes Membranprotein Signaltransduktion

Abbildungsverzeichnis [1] http://www.biokurs.de/skripten/bilder/membr3.jpg [2] Biochemie: Eine Einführung mit 40 Lerneinheiten von Philipp Christen,Rolf Jaussi, Springer (2005) [3] www.chemgapedia.de [4] http://www.bioc.uzh.ch/blexon/s:sphingomyelin [5] http://www.guidobauersachs.de/oc/lipide.html [6] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005) [7] http://www.rauhfasler.de/wp-content/uploads/2010/04/Fluid-mosaic-diagram-Singer-and-Nicholson-resized-150x150.jpg [8] http://www.uni-marburg.de/fb20/cyto/lehre/Jacob/membranen.pdf [9] Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011) [10] http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html [11] http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html

Quellen [1] Biochemie der Ernährungvon Gertrud Rehner,Hannelore Daniel, Spektrum, 3. Auflage (2010) [2] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005) [3]http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/transport/membranentransport.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/transport/membran_aufbau_funktion.vscml.html [4] http://de.wikipedia.org/wiki/Lipide#Membranbildende_Lipide [5] www.lipidsignalling.de/lipidimfocus/sphingolipide.php [6] Biochemie von H. Robert Horton,Laurence A. Moran,K. Gray Scrimgeour,J. David Rawn,Marc D. Perry, Pearson Studium, 4. Auflage (2008) [7] Biochemie Zellbiologie von Katharina Munk, Thieme (2008) [8] Kurzlehrbuch Histologie von Norbert Ulfig, 3. Auflage, Thieme (2003) [9] Molekulare Zellbiologie von Gerald Karp,Sebastian Vogel,Susanne Kuhlmann-Krieg, Springer, 4. Auflage (2005) [10] www.deutscher-apotheker-verlag.de/.../tx.../9783804721074_p.pdf [11] http://www.wissenschaft-online.de/abo/lexikon/biok/4304 [12] Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011) [13] http://cshperspectives.cshlp.org/content/3/10/a004697.full [14] http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html [15] http://www.fwf.ac.at/de/abstracts/abstract.asp?L=D&PROJ=P15486 [16] http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html [17] http://www.fwf.ac.at/de/finals/final.asp?L=D&PROJ=P12907 [18] http://www.uniprot.org/uniprot/P20073