Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen Master Seminar Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen Claudia Hahn 30.05.2012

Inhalt Einleitung Stokes Shift Qualitative und quantitative Messung Fluoreszenzmikroskop Nachweis des Proteins NHE 7 Problem des Fluoreszenznachweises Zusammenfassung

Betrachtung des Photons als Welle: E = hc/λ Einleitung Fluoreszenz: Fähigkeit der Absorption von Photonen und die spätere Abgabe eines Teils der absorbierten Energie Energie von Photonen: E = hv Betrachtung des Photons als Welle: E = hc/λ  Photonen geringer Wellenlänge besitzen eine höhere Energie als langwellige Photonen 3

http://www2. uni-siegen. de/dept/fb08/studium/pcfprakt/pics/jablonski http://www2.uni-siegen.de/dept/fb08/studium/pcfprakt/pics/jablonski.gif 4

Bei der Emission der Fluoreszenz wird zusätzlich Wärme abgegeben Stokes Shift Bei der Emission der Fluoreszenz wird zusätzlich Wärme abgegeben Folge: Anregungswellenlänge ist kleiner also Energiereicher Emissionswellenlänge ist größer also Energieärmer Der Shift (Verschiebung) beträgt 20-50 nm http://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/img_fluoreszenz/stokes-shift.png 5

Bei mehreren Parametern Emissionswellenlänge so wählen, dass sie keine andere Fluoreszenz hervorruft, die die eigentliche überlagert Bei mehreren Parametern Emissions- und Anregungswellenlängen dürfen sich nicht überlagern 6

Qualitative und Quantitative Messung Qualitative Messung Änderung der Intensität durch Bindung des Liganden (Fluo-4) => Keine Messung der Konzentration möglich http://www.systektum.de/uploads/pics/20.4.1.Signalauswertung_Intensit_tsmessung_1.jpg 7

=> Konzentrationsbestimmung möglich Quantitative Messung Abhängig von Ligandenkonzentration => Änderung der Anregungs- und Emissionsspektren (Fura-2) => Konzentrationsbestimmung möglich http://www-user.tu-chemnitz.de/~awill/diplom/Bilder/abb3_3.gif

Fluoreszenzmikrokop http://www.zoologie-skript.de/methoden/fluo/epifluol.jpg 9

Nachweis des Proteins NHE 7 1 µL gewaschene Erythrocyten in 1 ml PBS suspendiert Primärantikörper (1 Stunde) Zugabe des Sekundärantikörpers (Rhodamin gebunden) (1 Stunde) => Fluoreszenzmikroskopie 10

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 11

Kontrollmessung im FACS Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 12

Messergebnis der behandelten Zellen Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 13

Problem des Fluoreszenznachweises Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007 14

Problem des Fluoreszenznachweises Bindestelle des primären Antikörpers ist am C-terminalen Ende von NHE 7  Antikörper muss durch die Membran diffundieren Der sekundäre Antikörper muss ebenfalls durch die Membran diffundieren Am sekundären Antikörper ist Rhodamin gebunden Damit die Diffusion gewährleistet werden kann muss die Membran durchlässig gemacht werden  Verwendung verschiedener Suspensionslösungen 15

Permeabilisierung der Zellmembran PBS mit Triton-X Triton-X = Detergenz Permeabilisierung der Zellmembran Zunächst Test des Verhaltens der Zellen Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 16

Suche nach Substanz, die Zellen permeabel machen aber nicht zerstören PBS mit Glycerin Suche nach Substanz, die Zellen permeabel machen aber nicht zerstören => Glycerin Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 17

Mikroskopie der Zellen in PBS und Glycerin Viel Hintergrundfluoreszenz Keine spezifische Fluoreszenz erkennbar Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 18

Zunächst der Test ob die Zellen hämolysieren PBS mit DMSO Zunächst der Test ob die Zellen hämolysieren Geringfügige Formänderung, aber keine Hämolyse Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 19

Auch hier konnte nur Hintergrundfluoreszenz gemessen werden Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes 20

Zusammenfassung der betrachteten Versuche Die hier vorgestellten Substanzen hatten keinen Einfluss auf die Permeabilität der beiden Antikörper Neue Methoden zur Permeabilisierung der Membran müssen gefunden werden Verwendung eines anderen sekundären Antikörpers (Rhodamin evtl. zu groß)  Empfindlichere Nachweise: FACS oder konfokales Mikroskop Andere Nachweismethoden als Fluoreszenz einsetzen 21

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