Organisatorisches Anwesenheit Fragen?  Glukosebestimmung Protokoll 2 Photometer/Box

HEUTE (1) Glukosebestimmung (2) Auswertung der Luft- und Abklatschplatten (falls noch nicht geschehen) (3) Ausstrich der Abwasserkultur

Glukose-Stammlösung m = c × V × M 2 mM × 100 mL × 198 g/mol = 0,002 M × 0,1 L × 198g/mol = 0,0396 g 39,6 mg/100 ml

Wachstumskurve

Reaktion Messung einer gekoppelten enzymatischen Reaktion in Küvetten (1) Hexokinase: D-Glukose + ATP -> Glukose-6-P + ADP (2) Glucose-6-P-1-Oxidoreduktase: D-Glukose-6-P + NADP+ -> Glukono-1,5-lakton-6-Phosphat + NADPH + H+ Spontan: Glukono-1,5-lacton-6-Phosphat ->6-Phosphoglukonat Stöchiometrie: 1 mol Glukose = 1 mol NADPH gebildet Reduziertes NADPH wird bei 365 nm im Photometer gemessen.

Berechnung der Glukose-Konzentration (Einwaage) Eingewogen: 115 mg Glucose × H2O in 100 ml Minimalmedium Mr = 198 g/mol (wasserfreie Glucose 180!) Daraus folgt: 0,115 g in 0,1 L x g Glukose in 1L x = (1 L × 0,115 g) / 0,10 L x = 1,15 g Glukose in 1 L Daraus folgt weiter: x mol entsprechen 1,15 g x = (1,15 g × 1 mol) / 198 g x = 5,8 × 10-3 M Glukosekonzentration: x = 5,8 mM c = m / (V × M) = 0,115 g / (0,10 l × 198 g/mol) = 5,8 mM

Kalibriergerade (Doppelbestimmung) Pipettierschema im Skript (Seiten 22) !!! Ergebnis Photometer: 2 Werte bei 365 nm  Mittelwert – Leerwert = gesuchter Wert Auftragen gegen Glukosekonzentration Berechnung der Glukosekonzentration (x-Achse): 2 mM Glukose-Stammlösung 120 µl auf 1000 µl = Verd. faktor 8,3  2 : 8,3 = 0,24 mM 80 µl auf 1000 µl = Verd. faktor 12,5  ….

Proben des Wachstums (Doppelbestimmung!) Testansatz Heute Skript Tris-HCl-Puffer [μl] 740 690 Mg2+ [μl] 50 Probe [µl] 100 150 ATP-Lösung [µl] NADP+ -Lösung [μl] HK/G6P-OR [μl] 10 Gesamt-Volumen [μl] 1000 Verdünnung 100 µl auf 1000 µl 1: 10 im Testansatz 150 µl auf 1000 µl 1: 6,7 im Testansatz

Verdünnungen für Proben Wachstum Verdünnung im Testansatz Verdünnung zusätzlich Verdünnung gesamt lag-Phase (1. Wert) 1:10 1:5 1:50 exponentielle Phase 1 (Mitte) exponentielle Phase 2 (Ende) 1:2 1:20 stationäre Phase (nach abknicken) 1:1 (unverdünnt) nach Glukose-Zugabe

Proben des Wachstums (Doppelbestimmung!) Ergebnis Photometer: 2 Werte bei 365 nm  Mittelwert – Leerwert = gesuchter Wert Berechnung der Konzentration: A) Ablesen in der Kalibriergeraden B) Über Geradengleichung: y = 5 x x = ….

TO DO! (1) 2 Lösungen ansetzten 1 x / Box und dann aliquotieren in Reagenzgläsern: MgSO4 x 7 H2O Glukose-Stammlsg. Tris-Puffer (2) Kalibriergerade pipettieren (Vorbereitung ALLES bis auf Enzym; dann die Gruppen zeitversetzt (5 min!) Enzym zugeben) (3) Messung (mit 1er Küvette ohne spülen, niedrigste bis höchste Konzentration) (4) Grapische Auftragung der Kalibriergeraden (Millimeterpapier) (5) Verdünnungen der Wachstumsproben (6) Wachstumsproben pipettieren (Vorbereitung ALLES bis auf Enzym; dann die Gruppen zeitversetzt (5 min!) Enzym zugeben) (7) Messung und Berechnung der Glukosekonzentration (8) Eintragen der gemessenen Werte in eine Tabelle und die Wachstumskurve (9) Abgleich der quantitativen Messung mit der eingewogenen Glukose (7) WOCHENENDE 

Protokoll: Form und Inhalt Maximal 35 Seiten – weitere Seiten werden nicht korrigiert – die enthaltenen Daten gelten dann als fehlend! einheitliches Format des Protokolls Schriftart: Times New Roman: I l vs Arial: I l Schriftgröße: 12 Zeilenabstand: 1,5 Blocksatz Inhaltlich zusammenhängende Fließtexte formuliert im Passiv. Kein „Man“, „ich“ oder„ wir“ Keine Stichpunkte oder lose Aneinanderreihung von Stichwörtern. Chronologische Abläufe werden unabhängige von konkreten Tagen (Datum) oder Uhrzeiten beschrieben (kein Tagesprotkoll)

Gliederung Protokoll wird in Themenbereiche gegliedert: Mikrobiologische Techniken und Beschreibung ausgewählter Mikroorganismen Bakterielles Wachstum Isolierung und Charakterisierung eines Enterobakteriums Bakteriophagen Transformation

Themenbereiche Einleitung: Kurze Beschreibung der Thematik bzw. Erläuterungen zum Hintergrund des Versuches -> Hypothese Material und Methoden: Verweise auf das Praktikumsskript zulässig, wobei wesentliche Änderungen dokumentiert werden müssen. Ergebnisse: Diskussion:

Ergebnisse I. I. Mikrobiologische Techniken und Beschreibung ausgewählter Mikroorganismen Morphologie: siehe Skript S. 8 Mustertabelle Zellzählung: siehe Skript S. 14 Mustertabelle Sterilisationsmethoden: z. B. in Tabellenform darstellen oder Beschreibung im Text Luftplatten und Abklatschplatten: z. B. in Tabellenform darstellen oder Beschreibung im Text

Ergebnisse II. II. Bakterielles Wachstum Tabelle: siehe Skript S. 19 Mustertabelle 2. Wachstumskurve(n) und Glukosekonzentration sowie Kalibriergerade 3. Bsp. für Berechnung der Glukosekonzentration Berechnungen: 1. OD600 = 1 entspricht x Zellen/ml 2. Generationszeit g und Verdopplungszeit tD 3. Teilungsrate 4. Wachstumsrate

Ergebnisse allgemein Text gebundene Beschreibung der Ergebnisse thematisch zusammenhängender Versuche formuliert im Perfekt (keine Interpretation der Ergebnisse). Abbildungen Tabellen Beobachtungen Auf jede Abbildung und Tabelle muss mind. 1x im Fließtext verwiesen werden, und die Ergebnisse werden in Textform genannt. Abbildungen haben eine Bildunterschrift mit fortlaufender Nummerierung. Tabellen haben eine Tabellenüberschrift. Über- bzw. Unterschriften fassen die dargestellten Ergebnisse zusammen und erläutern den Sachverhalt so dass es nicht nötig ist, den Fließtext zu lesen (2-3 Zeilen). Wachstumskurven werden halblogarithmisch dargestellt: die x-Achse (Zeit) ist linear, die y-Achse logarithmisch. Zeitpunkte (z.B. Stunden), nicht die Uhrzeiten, angegeben, an welchen die Messwerte genommen wurden.

Dies ist keine Pfeife René Magritte, 1929: Öl auf Leinwand 59 × 65 cmCounty Museum, Los Angeles

Diskussion Text gebundene Interpretation der Ergebnisse thematisch zusammenhängender Versuche formuliert im Präsenz. ...

Allgemein gültige Regeln Organismen werden immer kursiv geschrieben und bei Ersterwähnung der vollständige Name genannt.  Ersterwähnung: Escherichia coli, Bacillus subtilis. Später: E. coli, B. subtilis Zwischen Werten und deren Einheiten bzw. des Prozentzeichens wird immer ein Leerzeichen gesetzt. Bsp.: 5 mm und 100 % unwissenschaftliche Begriffe (z. B. „leider“) und Ausdrucksweise (z.B. Die Kultur war ein bisschen gewachsen) vermeiden. Rechnungen immer mit Beispielrechnung