Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen Messung der Chlorophyllfluoreszenz mit dem PEA (Plant Efficiency Analyzer)

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Wie kann die Photosynthese und Transpiration grüner Pflanzen gemessen und beurteilt werden? 1.Die Messung des Gaswechsels CO 2 O 2 H 2 O-Dampf 2.Chlorophyllfluoreszenz Standalone „none-destructive“ gemeinsam mit Gasstoffwechselmessungen liefert wertvolle Informationen über den Photosyntheseapparat („Lichtreaktion“) – vor allem unter Stressbedingungen (Trockenstr., Kältestr., Lichtstr., Schädlingsbefall, Nährstoffmangel usw.) Es gibt 2 Arten der Fluoreszenzmessung: 1.Nicht-moduliert 2.moduliert

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Fluoreszenz – Konzept Pflanzen sind grün  absorbieren im Rot- bzw. Grünbereich Lichtabsorption hauptsächlich durch Chlorophyll-Moleküle der Grossteil Lichtquanten werden absorbiert – ein kleiner Teil des absorbierten Lichtes wird wieder als Fluoreszenz reemittiert Die Fluoreszenzabgabe beträgt ~ 5% des absorbierten Lichtes

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Chlorophylle - Strukturformeln Chlorophyll ist der zentrale Photosynthesefarbstoff Erste Studien: Willstätter et. al. (Nobelpreis 1915) Hans Fischer: Strukturaufklärung (1940) Hautpigmente Chlorophyll a Chlorophyll b  Tetrapyrrol  Porphyrin Mg 2+ - Ion im Zentrum Kovalent und koordinativ mit je 2 N-Atomen verbunden Chlorophyll a  Methylrest am Ring II Chlorophyll b  Formylrest am Ring II  Dieser geringe Unterschied hat jedoch einen großen Einfluss auf die Lichtabsorption  Ring IV mit Phytol verestert  hohe Lipdlöslichkeit  „hydrophober Membrananker“

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Chlorophyll a und b. Diese Moleküle absorbieren im Bereich des optischen Fensters der Atmosphäre maximal und ermöglichen damit den Pflanzen die relativ energiearme, nichtschädigende Strahlung zu nutzen. Dies ist möglich, da das Chlorophyllmolekül ein „hochkonjugiertes System“ darstellt. Im Fall des Chlorophylls b erstreckt sich das Molekülorbital aus π-Elektronen zusätzlich auf die Aldehydgruppe an C7, dadurch zeigt Chlorophyll b ein etwas anderes Absorptionsverhalten als Chlorophyll a. Chlorophylle - Strukturformeln

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Carotinoide - Xanthophylle  ~ 600 verschiedene Carotiniode  Lichtabsorption durch konjugierte Doppelbindungen (ab 3 konjugierten Doppelbindungen)  Carotine: nur aus Kohlenstoff und Wasserstoff aufgebaut o Primäre Carotiode  akzessorische Photosynthesepigmente o Sekundäre Carotiniode  Chromophorwirkung  Xanthophylle: sauerstoffhaltige Derivate der Carotine (Hydroxy-, Methoxy- Seitenruppen)  Absorptionsspektrum: nm  Diterpene  Kondensation von zwei Molekülen Geranylgeranyl-pyrophosphat  Lichtsammlerpigmente  Lichtschutz: o Umsetzung der potentiell schädlichen Singulett- und Triplett-Anregungsenergien in Wärme o Übernahme und effiziente Degradation der Anregungsenergie von Singulett – Sauerstoff.

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Carotiniode Spaltung in 2x Vitamin A1 Lebensmittelfarbstoff Tomaten - Hagebutten Terpene

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Lichtabsorption Wechselwirkungen von elektromagnetischer Strahlung mit Atomen. a.Übergang eines Elektrons vom Grundzustand auf ein höheres Energieniveau (angeregter Zustand) durch Absorption eines Quants elektromagnetischer Strahlung. b.Abgabe eines Quants elektromagnetischer Strahlung durch ein angeregtes Elektron bei seiner Rückkehr in den Grundzustand. c.Photoelektrischer Effekt: Das durch Absorption eines Quants hoher Energie (kurzer Wellenlänge, blau dargestellt) angeregte Elektron verläßt die Energiesphäre des Atoms. Quantenenergie: h* ν

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Elektronen-Zustände werden mit dem Jablonski-Diagramm beschrieben. Das Jablonski-Diagramm oder Jablonski-Termenschema veranschaulicht die möglichen Übergänge von Valenzelektronen in die verschiedenen Anregungszustände bei Einstrahlung von Licht. Es liefert eine anschauliche Darstellung für die Phänomene der Fluoreszenz und Phosphoreszenz, weshalb es für die UV/VIS-Spektroskopie eine große Rolle spielt. Bei Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen, werden Elektronen aus dem elektronischen Grundzustand ( So ) in energetisch höher liegende Zustände angeregt ( S 1, S 2, …). Die Relaxation in den Grundzustand kann nun auf unterschiedlichen Wegen erfolgen, die durch das Jablonski-Diagramm veranschaulicht werden. Absorbiert das Elektron die Energie des eingestrahlten Photons wird es vom Grundzustand in einen energetisch höher liegenden Zustand angehoben. Die Rückkehr in den Grundzustand erfolgt in den meisten Fällen durch strahlungslose Desaktivierung, wobei die aufgenommene Energie zur Anregung von Freiheitsgraden der Translation, Rotation und Schwingung genutzt wird (innere Umwandlung). In Konkurrenz hierzu steht die Rückkehr in den elektronischen Grundzustand durch Emission von Licht, was als Lumineszenz bezeichnet wird. Befindet sich das Elektron in einem angeregten Triplettzustand und ist somit zur Rückkehr in den elektronischen Grundzustand eine Spinumkehr vonnöten (Intersystem Crossing) so spricht man von Phosphoreszenz, beim spinerlaubtem Übergang aus einem Singulettzustand hingegen von Fluoreszenz.

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Rückkehr vom S 1 in den S 0 Zustand: 1.durch Fluoreszenz über die Abstrahlung eines einzelnen Lichtquants 2.thermische Deaktivierung durch Abgabe der Energie als Wärme (Energie geht dem System verloren) 3.Übertragung der Anregungsenergie auf ein benachbartes Pigmentmolekül 4.durch Abgabe der Energie an das Reaktionszentrum des Photosystems 5.indirekt als Phosphoreszenz über einen Triplettzustand Anm.: Phosphoreszenz tritt selten auf und ist unter normalen physiologischen Bedingungen kaum nachweisbar. Fluoreszenz: Intakte, photosynthetisch aktive Blätter:3-7% isoliertes Chlorophyll:~ 30%  Beurteilung des physiologischen Zustandes eines Probe möglich.

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Schematische Darstellung der Anregungszustände von Chlorophyll-a Das Jablonski-Termschema veranschaulicht die möglichen Übergänge von Valenzelektronen in die verschiedenen Anregungszustände bei Einstrahlung von Licht. Es liefert eine anschauliche Darstellung für die Phänomene der Fluoreszenz und Phosphoreszenz, weshalb es für die UV/VIS-Spektroskopie eine große Rolle spielt. WICHTIG: Durch die Interne Umwandlung wirken blaue Quanten wie rote Quanten, obwohl deren Energiegehalt grösser ist !!!

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Das Jablonski-Termschema dient zur Veranschaulichung der komplizierten Elektronenübergänge innerhalb der Moleküle. So erreichen z.B. vom Grundzustand S 0, meist ein Singulett-Zustand, die Elektronen die energiereicheren Zustände S 1 oder S 2, die ebenfalls Singulett-Zustände sind. Die Rückkehr in den Grundzustand erfolgt in den meisten Fällen durch strahlungslose Relaxation, wobei die aufgenommene Energie als Wärme abgegeben wird (internal conversion). Alternativ kann die Entspannung durch die Emission von Licht erfolgen, was zur Fluoreszenz führt. Die Elektronen der energiereichen Singulett-Zustände können sich durch Spinumkehr (intersystem crossing) in den etwas energieärmeren und somit stabileren Triplett-Zustand bringen. Unter einer erneuten Spinumkehr und der Emission von Licht fallen sie in den Grundzustand zurück. Dies ist das Prinzip der Phosphoreszenz. Auch innerhalb der Elektronenzustände sind die Energieniveaus nicht völlig einheitlich. Wegen mechanischer Schwingungen der Bindungen sind jedem Niveau zusätzlich etwa 30 bis 50 Schwingungsniveaus überlagert, die zu leicht unterschiedlichen Gesamtenergien führen. Diese werden nach ihrer Schwingungsquantenzahl v mit entsprechendem Index bezeichnet. Innerhalb eines Schwingungszustandes treten noch Rotationsniveaus auf, die mit I = 0, 1, 2... bezeichnet werden. Ein Übergang von z.B. S 0 in S 2 erfordert für Moleküle unterschiedlicher Schwingungszustände daher unterschiedliche Energien, die sich in unterschiedlichen Absorptionslinien widerspiegeln, meist jedoch nicht einzeln aufgelöst werden können. WICHTIG: Je höher das Energieniveau des angeregten Elektrons ist, desto größer ist sein Bestreben die Energie wieder abzustrahlen. Daher ist die Verweildauer von Elektronen z.B. im S 2 -Energiniveau kürzer als im S 1.

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Elektronentransportkette Q Q membrangeb. Chinon PQ PQ Plastochinonpool OEC OEC Sauerstoff prod. Komplex PCy PCy Plastocyanin FD FD FerredoxinNADP-Reduktase Potential-Differenz: ~ 1,13 eV Potential-Differenz: ~ 1,13 eV

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Chlorophyll Fluoreszenz stammt hautsächlich von PSII-Chlorophyllmolekülen Licht Chl a* Fluoreszenz Wärmeabgabe PS II Reaktionszentrum PS II Antennen (LHC II) WSE 2 H + + ½ O 2 H2OH2O ZQAQA e-e- e-e- e-e- Schreiber et al Photochemie P680

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Kautsky Hans W. Kautsky and A. Hirsch observed an increase of fluorescence intensity when darkadapted photosynthetically active sample were illuminated. They published their observations in a one single page article titled ‘New experiments on carbon dioxide assimilation’ in the journal "Naturwissenschaften". The time course of Chl-fluorescence, observed with the authors’ eyes, was qualitatively correlated with the time course of CO 2 assimilation, published earlier by Otto Warburg in Kautsky first proposed the singulet oxygen as a quencher of fluorescence during CO 2 assimilation. His work was long ignored and it was only in 1964 that his research work on the role of singlet oxygen in photosynthesis was recognized. The results of Kautsky were the base for very important discoveries in photosynthesis. Kautsky, H., Hirsch, A. (1931) Neue Versuche zur Kohlensäureassimilation Naturwissenschaften 19: Govindjee (1995), Sixty-three years since Kautsky chlorophyll a fluorescence, Aust. J. Plant Physiol. 22,

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Was ist die Kautsky-Kurve? Zur Aufnahme einer Kautsky-Kurve wird ein vor- verdunkeltes Blatt (20-30 min) mit Starklicht (Intensität > Sonnenlicht) kontinuierlich belichtet. Das emittierte Fluoreszenzlicht steigt rasch an und erreicht das Maximum innerhalb von ms. Schon innerhalb der 1. Sekunde fällt aber wieder die Fluoreszenz-Intensität und erreicht schließlich eine tiefer liegenden steady-state-Wert. Der Anstieg der Kurve zu Beginn wird durch Sättigung der Reaktionszentren, vor allem im Photosystem II verursacht. Im Minutenbereich steigt allmählich die Photosyntheserate an (z.B. CO 2 -Aufnahme). Dadurch sinkt die Fluoreszenzabgabe (= photochemisches Quenching).

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Kautsky – Kurve Dunkel-adaptiertes Blatt  BELICHTUNG  Enzymsystem der Photosynthese läuft nicht sofort an („lag-phase‘)  Elektronen der Elektronentransportkette werden nicht sofort "abgenommen"  Stau  erhöhte Fluoreszenz  Nach ~ 2- 3 Minuten synchronisieren sich die Komponenten  Chlorophyllfluoreszenz sinkt auf einen Bruchteil des Ausgangswertes ab Blockade der Lichtreaktion (z.B. Herbizid)  Kein Absinken der Fluoreszenz Weitere Ursachen:  Hemmung des Elektronentransports bei der Photophosphorylierung (Mangel an ADP bzw. P i )  Störungen bei der Dunkelreaktion auftreten (verminderter Verbrauch an ATP)  Trockenstress: die einzelnen Komponenten werden unterschiedlich beeinträchtigt und synchronisieren sich erst nach einer längeren Periode  Schädigungen von Proteinen (vor allem im PSII) durch 1 O 2  PHOTINHIBITION

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Typische Chlorophyllfluoreszenzkurve nach KAUTSKY, gemessen an dunkeladaptierten Nadeln von Pinus sylvestris. A = schnelle Kinetik [0 - ~ 500ms] B = langsame Kinetik [> ~ 500ms] Die typische Kurvenniveaus sind mit O-I-D-P-S-M-T bezeichnet. Photosynthetische Kapazität: (Fm – Fo)/Fm = Fv/Fm Vorverdunkelte Blätter von gesunden, nicht gestressten Pflanzen zeigen einen Fv/Fm-Wert zwischen 0.8 – Messgerät: PSM-Fluorimeter bei 20°C und 100µmol Photonen*m -2 *s -1 Bolhàr et. al. 1988

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UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Starklichtwirkung auf intakte Blätter bei 25°C bzw. 6°C: PHOTOINHIBITION stärker unter niederigerer Temperatur Schäden durch Starklicht ist reversibel – Reparatur dauert aber zumindest 20 Stunden

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie Photosynthesis in silico

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie PEA leafclip Handy-PEA Plant Efficiency Analyser PEA Continuous Fluorescence

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie PEA_2 PLANT EFFICIENCY ANALYSER (PEA) SPECIFICATIONS: Illumination o Red LED, 650 nm (focused ultra-bright red LED‘s) o Saturating light intensity > 3000 µmol m -2 s -1 PAR, selectable in 1% steps between 0 and 100% Detector: o PIN photodiode and fast detection circuit protected by long-pass I.R. photographic filter (NIR- filter) Electronics: o 100 kHz initial sampling rate (for correct Fo determination), then decreasing stepwise during measurement Memory: 64K CMOS EPROM containing program. 140K RAM for storage of data. This could be used for: 75 full data files for 1 sec record or 40 full data trace files for 120 sec or 8000 parameter only sets. Record Length: User selectable in 1 second steps between 1 and 120 secs. Battery Life: up to 8 hours dependent upon light intensity and record interval. Measured Parameters: F o, F m, T fm, Area, data points for OJIP-Test Calculated Parameters: F v, F v /F m.

Department für Molekulare Systembiologie UE Wachstum und Stoffwechsel der Pflanzen © W. Postl Department für Molekulare Systembiologie PEA_2 PLANT EFFICIENCY ANALYSER (PEA) Durchführung der Messung: Clips anbringen Metallschieber zu ~ Minuten warten Messkopf aufsetzen Metallschieber auf Messung starten (Knopf auf Messkopf drücken) Ablesen der Fv/Fm-Werte – Eintragen in Liste