Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung

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1 Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung
Dipl. Ing. Anne Bärenwaldt AG Nimmerjahn

2 Fc Rezeptoren (FcR) Rezeptoren für Immunglobuline
Expression auf Immunzellen Binden konstante Domäne der schweren Kette von Antikörpern  Verbindung zwischen adaptiven Immunsystem und Effektorfunktionen des angeborenen Immunsystems

3 FcR Arten Für jeden AK Typ gibt es Fc Rezeptoren Fc Rezeptor für
IgA  Fc a R IgG  Fc g R IgE  Fc e R IgM  Fc m R IgD  Fc d R Maus  4 Gene für FcgRI FcgRII FcgRIII FcgRIV Mensch  8 Gene für FcgRI (A, B, C) FcgRII (A, B, C) FcgRIII (A, B)

4 Fc g Rezeptoren Größte und am häufigsten vorkommende Gruppe von FcR
verschiedene Spezifität, Affinität, Struktur, Expression und biochem. Funktion FcgRI FcgRIIB FcgRIII FcgRIV a g2 Mouse ITAM ITIM a g2 a g2 a high affinity low/medium affinity FcgRI FcgRIIB FcgRIIA hFcgRIIIA a g2 Human ITAM ITIM g2 a a a

5 FcgR Aktivierende FcgR Inhibierende FcgR
FcgRI, FcgRIIA, FcgRIII Inhibierende FcgR FcgRIIB werden gemeinsam auf Effektorzellen exprimiert Makrophagen, Neutrophile, NK, dendritische Zellen (DC), Mastzellen Bindung von Immunkomplexen (IC) aktiviert aktivierenden und inhibitorischen Signalweg Schwellenwert für Aktivierung der Zelle wird gesetzt die Stärke der Immunantwort bestimmt Vielzahl an downstream Antworten wird dadurch reguliert Degranulation, Phagozytose, Antigen-Präsentation, antibody-dependend cellular cytotoxity (ADCC)

6 Signalleitung Aktivierende FcgR benötigen für Signalleitung assozierte Adaptermoleküle Adaptormolekül ist vom Zelltyp abhängig Am häufigsten ‚common g chain‘ Adaptor hat immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) Inhibitorischer Rezeptor besitzt immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) Braucht kein Adaptormolekül FcgRI a g2 ITAM ITIM FcgRIIB a

7 Signalleitung aktivierender FcgR
Src-family Kinase phosphoryliert ITAM SH2 Bindedomäne entsteht Syk bindet Signalkaskade wird eingeleitet Ras/Raf/MAP Kinase pathway wird aktiviert Kalzium abhängige Signalwege aktiviert downstream signaling pathways (ERK, p38, JNK) cell activation ADCC Phagocytosis Cytokine release Oxidative burst

8 Signalleitung inhibitorischer + aktivierender FcgR
Co-Ligation beider FcgR führt zu Phosphorylierung des ITIM vom FcgRIIB SHIP bindet an entstandene SH-2 Dömäne Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-γ)

9 Inhibitorischer FcgRIIB (CD32)
Größe: 40 kDa Aufbau: 2 extrazelluläre Domänen 1 Transmembranregion 1 cytoplasmatischer Schwanz geringe Affinität für monomeres IgG hohe Avidität für Immunkomplexe Signalleitung mittels ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) 2 Isoformen IIB-1 Signalwirkung IIB-2  Signalwirkung + Internalisiert/phagozytotisch Einziger FcR auf B-Zellen ITIM FcgRIIB a

10 FcgRIIB Signalleitung in B-Zellen
Co-Ligation mit: Sich selbst  führt zu Apoptose BCR  Verminderung des BCR Aktivierungssignal  anti-apoptotisches Signal Co-Ligation mit BCR führt zur Aktivierung der Kinase Lyn Lyn phosphoryliert ITIM des FcgRIIB Initiation des Signalwegs (SHIP) Blockiert Ras Weg und Kalzium-signalkette (Btk und PLC-g)

11 FcgRIIB als Toleranzkontrollpunkt
FcgRIIB setzt Schwellenwert für Aktivierung von B-Zellen Induzierte Apoptose durch Selbst-Ligation  mögliche Beteiligung an Erhalt der Toleranz  mögliche Deletion selbst-reaktiven B-Zellen  FcgRIIB wichtig für B-Zell Toleranz Untersuchung von Toleranz: Autoimmunanfällige Mausstämme (NZB, BXSB, NOD, MRL/lpr) entwickeln spontan Autoimmunität (z.B. SLE)

12 FcgRIIB und Toleranz Balb/C Bolland und Ravetch 2000
Wie WT B6 Erhöhte Sterberate Entzündungen in Vielzahl von Organen Erhöhter Proteingehalt im Urin Glomerulonephritis Nierenversagen  genetischer Hintergrund ist sehr wichtig Bolland und Ravetch 2000 Fcgr2b -/- Mäuse (Balb/C und C57.B6)

13 Test auf anti-nucleäre AK
Immunfluoreszenzfärbung von Hep-2 Zellen Inkubation mit Serum der Mäuse Detektion von gebundenem IgG mit FITC-anti-mouse IgG ELISA IgG AK gegen: dsDNA dsDNA mit Histon 1 dsDNA mit Histon 2A und 2B  Toleranzverlust in FcgRIIB-/- Bolland und Ravetch 2000

14 Wiederherstellung der Toleranz durch FcgRIIB
McGaha et al. 2007 Retroviraler Vektor für Expression von FcgRIIB Fcgr2b Kontrollvektor Gewinnung von KM-Zellen aus autoimmunanfälligen und FcgRIIb-/- Mäusen Transduktion mit retroviralem Vektor Rekonstitution bestrahlter Mäuse mit autologem tranduziertem KM FcgRIIB Mock

15 Untersuchung der Mäuse
Überlebensrate NZM2410 Indirekter Immunofluoreszenzassay ANA Reaktivität gegen fixierte HepG2 Zellen Fcgr2b Mock ELISA Verbessertes Überleben Weniger Auto-AK McGaha et al.

16 Schlussfolgerung FcgRIIB ist wichtig für den Erhalt der Toleranz
Bei Fehlen des Rezeptors entsteht IgG anti-DNA AK  Verlust von Toleranz Herstellung der Toleranz durch Wiederherstellung des FcgRIIB Levels Ist wichtiger Kontrollpunkt in peripherer Toleranz

17 Einfluss von FcgRIIB in B-Zell-Entwicklung
Wo genau reguliert er?

18 Keimzentrum (germinal center)
Induzierbare lymphoide Mikroumgebung Entstehen durch Antwort auf T-abhängige Antigene Entstehen durch Einwanderung aktivierter B-Zellen in die Lymphorgane AG wird im GC als Immunkomplex (IC) von folliculären dendritischen Zellen (FDC) präsentiert Hohe Mutationsfrequenz in variabler Region des BCR in GC-B-Zellen Selektion von hoch affinen B Zell Varianten Formation von Memory B Zellen

19 Keimzentrum Durch Mutation auch BCR mit verminderte Affinität
 muss Mechanismen geben, die zwischen hoch und niedrig affinen B-Zellen unterscheiden Annahme: B Zellen mit hoch-affinem BCR werden bevorzugt stimuliert  Aufnahme von AG und Präsentation für Th Lymphozyten  Dieses Modell bezieht sich nur auf den BCR Ignoriert den Schwellenwert von FcgRIIB bei der B-Zell Selektion durch IC Interaktion FcgRIIB kann durch Apoptosesignal niedrig affine B-Zellen eliminieren

20 Rao et al. 2002/Jiang et al. 1999 Untersuchung der Expression von FcgRIIB in Keimzentrumszellen

21 Reduzierte FcgRIIB Expression in GC-B-Zellen
Facs 2.4G2  FcgRIIB K9.361 FcgRIIB B220+IgD+GL7- Nicht GC Zellen B220+IgD-GL7+  GC B-Zellen Milzzellen Immunisiert mit NP-CGG Histologie 9 Tage nach Immun. Histologie Milz 2.4G2  FcgRIIB GL7  GC FDCs exprimieren auch FcgRIIB  FDCs sind resistent gegen Bestrahlung  Empfängermaus hat IIB neg. FDCs und IIB pos. B-Zellen (aus Donor) Bestrahlte IIB -/- Mäuse Rekonstitution mit KM von IIB+/+ Mäusen  Färbung des IIB Rezeptors im GC nur bei B-Zellen Chimäre Mäuse FcgRIIB in GC, auch in FDC reichen Regionen  reduzierter Schwellenwert für B-Zell Aktivierung Rao et al. 2002

22 Verminderte FcgRIIB Expression in GC B-Zellen von autoimmunanfälligen Mäusen
Milzzellen von 8-Mo. alten immunisierten Tieren Autoimmunanfällig (SLE) NZB (NZB x NZW)F1 Nicht-anfällig NZW geringere Expression von FcgRIIB auf GC-B-Zellen in allen Mäusen In autoimmunanfälligen Mäusen ist FcgRIIB Expression auf GC B-Zellen geringer als bei nicht anfälligen Mäusen Jiang et al. 1999

23 Zusammenfassung Rao et al./Jiang
Expression von FcgRIIB ist in GC B Zellen herunterreguliert FcgRIIB Expression in Autoimmunanfällige Mausstämme noch geringer Auch GC Bildung in chimären Mäusen die kein FcgRIIB auf FDCs haben

24 Wirkmechanismus von FcgRIIB?
Aufgabe von FcgRIIB im GC/ bei der Affinitätsreifung? Welchen Effekt hat die verringerte FcgRIIB Expression im GC? Rolle von FcgRIIB in Toleranzerhaltung?

25 Modellsystem 3H9 Maus Transgenes knock-in Modell für Anti-DNA exprimierende B-Zellen Rearrangiertes schweres Kettengen (anti-DNA) wird benutzt Aus DNA bindendem Hybridoma aus MRL.lpr Maus Insertion im Igh Locus (IgMa Allel) Editierung der leichten Kette ist wichtig für den Erhalt von Toleranz Durch Kombination mit verschiedenen Leichten Ketten entstehen autoreaktive AK Weiterentwicklung des 3H9 Modells durch Einfügung weiterer Argininreste  DNA Bindung von AK meist über Arg-Reste 3H9/56R  ein Arg Rest 3H9/56R/76R  zwei Arg Reste

26 Modellsystem 3H9 Maus Mit steigender Arg Anzahl steigt Autoreaktivität der produzierten AK (je basischer  höhere Autoreaktivität)

27 Fukuyama et al. 2004 Verwendung von 3H9 und 3H9 56R Mäusen mit und ohne Fcgr2b Expression Balb/C und C57.B6 Untersuchung der Toleranzerhaltung

28 Spezifität des genetischen Hintergrundes
Balb/C Hintergrund: Sowohl bei niedrig-affinem 3H9 Allel als auch beim hoch-affinen 56R Allel wurde Toleranz in Balb/C Mäusen erhalten C57.B6 Hintergrund: Höhere IgM und IgG Produktion bei 56R ELISA Anti-DNA IgM IgG Serum C57.B6: 12 Wochen alt Fukuyama et al.

29 Mechanismus zum Erhalt der Toleranz
Untersuchung zur Auswahl der leichten Kette in den Mausstämmen Vκ21D  Leichte Kette, die am effektivsten die Autoimmunität der schweren Kette unterdrückt Vκ38c  weniger effizient Veränderte Benutzung von leichten Ketten in den Mausstämmen Unabhängig von FcgRIIB Fukuyama et al.

30 FcgRIIB Defizienz steigert IgG anti-DNA Produktion
ELISA IgG IgM Fcgr2b Defizienz erhöht Anzahl von IgG anti-DNA durch erhöhtes Auftreten von IgG produzierenden Plasmazellen/Plasmablasten Serum Anti-DNA Splenocyten Fukuyama et al.

31 IgG anti-DNA ist pathologisch
Histologie der Niere C57.B6 Fcgr2b-/- entwickeln nach 6 Mo. starke Glomerulonephritis Nur 56R Fcgr2b-/- zeigte gleiche Pathologie wie pos. Kontrolle (Fcgr2b -/-) Glomerulonephritis Immun-Komplex Ablagerung Komplement C3 Ablagerung Nur eine limitierte AK-Spezifität Nach 9 Mo. Fukuyama et al.

32 Zusammenfassung Fukuyama et al.
„Editing“ ist der primäre zentrale Mechanismus um autoreaktive B-Zellen in unschädliche B-Zellen umzuwandeln Nutzung verschiedener leichter Ketten in unterschiedlichen Mausstämmen FcgRIIB Defizienz führt zu Produktion von IgG produzierenden Plasmablasten negatives Feedback-Signal ist gestört Proliferation autoreaktiver Plasmazellen

33 Paul et al. 2007 Rolle von FcgRIIB in der peripheren B-Zell Toleranz
Prinzip: follicular exclusion Ansammlung von autoreaktiven B-Zellen an der T-B Grenze von Milzfollikeln Hypothese: folliculare exclusion ist abhängig von normalem FcgRIIB signalling Versuchsprinzip: 3H9 Mäuse defizient in FcgRIIB  wenn FcgRIIB an peripherer Toleranz und follicular exclusion beteiligt ist, sollte in 3H9FcgRIIB-/- Tieren ein Verlust der folliculärer Exclusion auftreten

34 Erhöhte Anzahl autoreaktiver B-Zellen in FcgRIIb -/-
Milz Bei Paarung von 3H9 mit λ1 leichter Kette entsteht autoreaktiver AK λ1 B-Zellen exprimieren transgenen IgMa Allotypen FcgRIIb-/- Mäuse haben erhöhte Frequenz von λ1 B-Zellen  autoreaktive AK für weitere Nachweise Paul et al.

35 Verlust der follicular exclusion bei FcgRIIb Defizienz
Histologische Untersuchung der Milz 3H9FcgRIIB+/+B6 Mäuse: λ1 B Zellen an T-B Grenze von Milzfollikeln 3H9FcgRIIB-/-B6 Mäuse: λ1 B Zellen in gesamten Follikel verteilt λ1 B Zellen B-Zell Zone T-Zell Zone Keimzentren sind grün Stärkere Keimzentrumsaktivität in FcgRIIB-/- Mäusen λ1 B-Zellen im Keimzentrum 100-fach 600-fach Paul et al.

36 Erhöhte Anzahl von Plasmazellen in 3H9RIIB-/- Tieren
FACS Milz B220: B-Zell Marker CD138: Marker für Plasmazellen Kein Unterschied bei IgM anti-DNA produzierenden B-Zellen 8x höhere Anzahl an IgG anti-DNA produzierenden B-Zellen in 3H9RIIB-/- Tieren Klassenwechsel der autoreaktiven B-Zellen hat stattgefunden ELISPOT Anti-DNA Paul et al.

37 Erhöhte Anzahl von anti-DNA-AK im Serum
Serum Anti-DNA 3H9FcgRIIB-/- Mäuse: Höhere Anzahl an IgG und IgM anti-DNA AK Alle Beobachtungen waren Altersabhängig: Junge 3H9FcgRIIB-/- Mäusen (2 Monate alt) zeigten WT verhalten Alte 3H9FcgRIIB-/- Mäusen (9 Monate) zeigte IgG Anti-DNA Paul et al.

38 Zusammenfassung Ergebnisse (Paul et al.)
FcgRIIB ist notwendig um Zellen aus Keimzentrum auszuschließen  Klassenwechsel zu IgG wird dadurch verhindert Keine Plasmazellentwicklung von autoreaktiven B-Zellen

39 Zusammenfassung: Bedeutung von FcgRIIB
FcgRIIB hat wichtige Funktion in der peripheren Toleranz Ist innerhalb und außerhalb des Keimzentrums unterschiedlich exprimiert (Rao et al.) In autoimmunanfälligen Mäusen im Keimzentrum noch schwächer exprimiert (Jiang et al.) Reguliert Anzahl IgG produzierender Plasmazellen/-blasten Verhindert das Einwandern autoreaktiver B-Zellen in die Milzfollikel (Paul et al.)

40 Unser Projekt Untersuchung der Funktion von humanem FcgRIIB bei der Toleranzerhaltung

41 FcgRIIB und Toleranz beim Menschen
systemischer Lupus Erythematodes (SLE) hohe Anzahl von autoreaktiven IgG Antikörpern Allele Varianten von FcgRIIB Ile232Thr  Assoziation in verschiedenen Asiatischen Bevölkerungen  keine Assoziation in Europäern Promoter Polymorphismus in Europäern Verminderte Expression in memory B-Zellen in SLE Patienten in der Afrikanisch-Amerikanischen Bevölkerung  Hohe Heterogenität im Menschen  Genetischer Hintergrund ist sehr wichtig

42 Testsystem notwendig, dass menschliches Immunsystem darstellt
Mensch vs. Maus FcgR von Maus und Mensch unterschiedlich Bisher nur epidemiologische Assoziationen beim Menschen Testsystem notwendig, dass menschliches Immunsystem darstellt  humanisierte Maus Sind Ergebnisse aus Mausstudien auch für das menschliche Immunsystem gültig?

43 Mäuse entwickeln menschliches Immunsystem
Versuchsaufbau Vorbereitung der hHSC: Promoter miRNA GFP Reporter Gen n Isolation Transduktion mit lentivirus kodierter miRNA hHSC Vorbereitung der Mäuse: Bestrahlung Neugeborenen Rag2-/- NOD/SCID Rekonstitution mit hHSC Mäuse entwickeln menschliches Immunsystem

44 Untersuchung des Immunstatus
Gesundheitszustand Überleben Vitalität Veränderte B-Zell Antwort Schwellenwert Antikörper-Affinität Veränderter Klassenwechsel anti-DNA AK antinucleäre AK anti-Chromatin AK Untersuchung des Auftretens von SLE Entwicklung von Glomerulonephritis Nierenfunktion Proteingehalt im Urin histologische Untersuchung der Leber

45 Derzeitige Arbeit Klonierung von Fc g Rezeptoren (inhibitorisch and aktivierend), CD22 und CD72 Stabile Transfektion von CHO Zellen mir diesen Plasmiden  Zelllinien exprimieren diese Rezeptoren Klonierung von miRNA/shRNA Stabile Transfektion von CHO Zelllinien und primären B-Zellen FcgRIIB, CD22, CD72 Aktivierende FcgR Effektivitätstest der miRNA/shRNA (positive Kontrolle) miRNA/shRNA sollten keinen Einfluss auf diese haben (negative Kontrolle)

46 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit