Elektrophorese, Immunodetektion

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1 Elektrophorese, Immunodetektion
BIOCHEMIE Elektrophorese, Immunodetektion

2 Regulation von Enzymaktivitäten
- Ebene 1 - Enzyme können auf folgenden Ebenen reguliert werden Regulation der bestehenden Enzymmenge Post-translational durch reversible, kovalente Modifikation (Phosphorylierung, Reduktion) pH-Wert, (Co-)Substratkonzentration Effektoren Enzym-Inhibitorprotein-Interaktionen ( Proteine) Enzymreinigung Chromatographie

3 Regulation von Enzymaktivitäten
- Ebene 2 - Regulation der Enzymproteinmenge Genexpression Transkription (Induktion/Repression) Splicing, mRNA Stabilität Translation Proteolytischer Abbau Enzymproteingehaltsbestimmung Elektrophorese, Blotting

4 Elektrophorese Prinzip
„Wanderung eines geladenen Teilchens im elektrischen Feld“ Proteine, DNA, RNA, organische Säuren, Kationen etc. Aminosäuren sind amphotere/zwitterionische Verbindungen

5 Elektrophoretische Trennung
von Proteinen Proteine weisen positive und negative Ladungen auf ihrer Oberfläche auf.

6 Matrices bzw. Gele Polyacrylamidgele Stabilisierung der wandernden
Proteinbanden in Gelen

7 Matrices bzw. Gele Polyacrylamidgele
Die Monomerkonzentrationen bestimmen die Porengrössen der Polyacrylamidgele T [%] = (a + b) * 100 / V C [%] = b * 100 / (a + b) a....Gewicht an Acrylamid b....Gewicht an Methylenbisacrylamid V....Volumen in mL

8 Zusammenhang zwischen Porengrösse und %T sowie %C
Fall A C konstant T erhöht Porenweite sinkt Fall B T konstant C erhöht Peakverteilung Minimum bei 4% C, bei höheren und niedrigeren Konzentrationen nehmen die Porengrössen wieder zu

9 Geometrie der Gelelektrophorese
Rundgele vs. Flachgele horizontal vs. vertikale Systeme

10 Elektrophorese-Apparaturen

11 Elektrophoretische Trennprinzipien Polyacrylamid-Gelelektrophorese
3 2 1

12 Bildung des pH-Gradienten
Isoelektrische Fokussierung Bildung des pH-Gradienten Trägerampholyte sind Oligoamino-oligocarboxylsäuren Sie weisen ver-schiedene Isoelek-trische Punkte auf

13 Elektrophoretische Mobilität v
Trennung von Proteinen erfolgt aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität v = E . z / (6p h r) E...elektr. Feld h...Viskosität Nettooberflächenladung z pH-abhängig Molekülgrösse, -form r Stoke`scher Radius + - Anode Kathode

14 Kombination aus Isotachophorese und Zonenelektrophorese
diskontinuierliche PAGE Kombination aus Isotachophorese und Zonenelektrophorese

15 native PAGE Proteintrennung auf Basis Oberflächenladung und Grösse
keine Proteindenaturierung Proteintrennung auf Basis Oberflächenladung und Grösse d.h. Proteine verschiedener Molekülgrösse können in der nativen PAGE gleich schnell wandern kann auch zur Reinigung nativer Proteine eingesetzt werden optimierbar über Pufferzusam- mensetzung, pH-Wert und Porengrössen

16 Sodium dodecylsulphate
SDS-PAGE Sodium dodecylsulphate SDS ist ein anionisches Detergens, das in stöchiometrischem Verhältnis von 1.4 g SDS je an 1 g Protein bindet Hierbei wird die native Konfiguration in eine ellipsoide K. aufgefaltet

17 SDS-PAGE Vorteile die Oberflächenladungen der Proteine werden maskiert
die Menge der „neuen“ negativen Ladungen korrelieren mit der Masse des Proteins (in Dalton) alle Proteine besitzen nach der Auffaltung diesselbe Konfiguration die Trennung erfolgt folglich nach Molekularmasse der Proteine Ausnahmen: Glykoproteine, Peptide < 15kDa

18 Auswertung des Molekulargewichts Kalibration Relative Mobilität gegen
log Molekularmasse ergibt lineare Beziehung Kalibration mit Polypeptiden bekannter Molekularmasse

19 SDS-PAGE Beispiel Gradientengel Coomassiefärbung
Porengrössenverteilung im Gel kontinuierlich ansteigend gewährleistet hohe Trennleistung und Schärfe über weiten Molekularmassenbereich von Proteinen

20 unspezifische Färbungen
Visualisierung unspezifische Färbungen Allgemein erfolgt nach der PAGE eine Fixierung der Polypeptidbanden mit Alkoholen/Säuren oder durch Blotting Färbung Coomassieblau-Färbung (> 1 ng pro Proteinbande) siehe auch Bradford-Assay Silber-Färbung (20-200x sensitiver) # Verstärkung der Ag+-Bindung (Glutaraldehyd) # Ag+-Imprägnierung # Waschung # Entwicklung: Ag+-Reduktion zu Ag am Protein

21 unspezifische Färbungen
Visualisierung der Polypeptidbanden unspezifische Färbungen

22 Visualisierung weitere Varianten Enzymaktivitätsfärbungen
nur bei nativer PAGE künstliche Substrate / Cofaktoren Bildung eines unlöslichen Produktes in der Enzymreaktion Autoradiographie von markierten Proteinen

23 Western-Blotting Prinzip
Immobilisierung von Proteinbanden durch Transfer aus dem Gel auf proteinbindende Membranen Transfer wird meist elektrophoretisch durchgeführt (Elektroblotting) Typische Membranen bestehen aus Nitrocellulose, Nylon oder PVDF (Polyvinylidendifluorid) spezifische Polypeptiddetektion auf der Membran meist per Immunodetektion, die in PAGelen nicht möglich wäre (MG)

24 Western Blotting Durchführung

25 Antigen-Antikörper-Reaktion
Antikörper -Aufbau -Konfigu- ration Paratope

26 Antigen-Antikörper-Reaktion Antigen-Determinanten
Epitope

27 Immunodetektion Ablauf Nachweisreaktion SekundärerAntikörper
Primärer Antikörper

28 Immunodetektion Nachweisreaktion

29 Ausblick