Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff.

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1 Die Parochipanalyse Institut für orale Mikrobiologie Univers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads c.m.d. Wiebke Schulthoff

2 Das Verfahren zur Auswertung der Genchipanalyse Der ParoChip1 ist ein Glasobjektträger, der eine Patientenprobe aufnehmen kann. Er umfasst auf einer Fläche von 24 mm² 86 Messpunkte, die einen Durchmesser von ca. 200 µm und einen Abstand von ca. 300 µm haben. Für jedes Bakterium liegen drei Messpunkte vor. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei dem neueren ParoChip2 um einen Plexiglasobjektträger, der 12 Patientenproben in 6x6mm großen Vertiefungen aufnehmen kann. In jeder dieser Vertiefungen liegen auf 8 mm² 120 Messpunkte, die einen Durchmesser von 150 µm und einen Abstand von 275 µm haben. Für jedes Bakterium liegen fünf Messpunkte vor. Für beide Chips wurden Fluorophor markierte Primer für die PCR (cy5 markiert) und Fluorophor markierte Sonden für interne Kontrollsysteme (cy3 markiert) verwendet. Für die Auswertung wird der Chip im Microarray Scanner (GenePix Personal 4100A von Axon) bei den Wellenlängen λ 1 =532 nm (Cy3) und λ 2 =635 nm (Cy5) eingelesen. Durch die Anregung mit monochromatischem Licht werden die gebundenen und markierten Sonden detektiert. D.h.: Grün=Cy3 gebundene Sonden Rot=Cy5 gebundene Sonden

3 Zur Erläuterung der Begriffe: feature :Jeder Punkt dieses Bildes ist ein feature. Sie werden über die in der Datenliste enthaltenen feature- indicator definiert. Das Bild: ParoChip1 1 Block mit: Die Datenliste (array-list): Gitter, das über den Block gelegt wird und alle Informationen enthält: Position und Größe der feature-indicators, sowie die Identifizierung dieser. 8 Reihen = „rows“ 12 Säulen = „columns“ feature-indicator: Er kann jedem feature individuell angepasst werden und ist die Einheit, der die Analyse zu Grunde liegt Unserer Auswertung liegt die GenePix Array List ( =Datenliste ) zu Grunde. Sie ist ein Gitter, das die Größe und Position des Blocks, sowie das Layout der feature-indicator darin umfasst. Jedem feature-indicator ist dabei eine eindeutige Identifizierung sowie ein Name zugeordnet.

4 Das Bild: ParoChip2 1 Block mit 10 Säulen 12 Reihen Mit bereits darüber gelegten Datenliste Im Vergleich zu ParoChip1 hat ParoChip2 insgesamt 12 Blocks. D.h. es können auf diesem Chip 12 Proben gleichzeitig ausgewertet werden. Der gesamte ParoChip2: Hier sind 9 Blocks zu sehen, d.h. es wurden 9 Proben aufgebracht. E2, F1 und F2 sind noch frei und können noch genutzt werden.

5 Bei unserer Auswertung handelt es sich um eine Bildanalyse, bei der Pixelintensitäten gemessen werden. Für die gesamte Messung der Pixelintensitäten gelten folgende Messbereiche: Schwarzer Bereich: Messbereich der Hintergrund- Pixelintensitäten, Der Durchmesser des Messkreises ist dreimal so groß wie der des zugehörigen feature- indicators Dunkelgrauer Bereich: Messbereich der feature- Pixelintensitäten, Pixel, die den feature- indicator berühren, jedoch nicht vollständig darin liegen, werden nicht berücksichtigt Hellgrauer Bereich: Bereich nicht berücksichtigter Pixel

6 Die Ergebnisse der Bildanalyse Durchmesser des feature- indicators in µm Angabe der feature- Position im Block Name und eindeutige Identifikation des jeweiligen feature in Anlehnung an die Datenliste (array list) X- bzw. Y- Koordinate in µm ausgehend von der Mitte eines jeden feature-indicators. Der 0I0 – Punkt des Bildes ist dabei oben links Das Programm kann selbständig einzelne features durch „flags“ bewerten. Dabei wird „good“, „bad“, „absent“ und „not found“ unterschieden. Es ist auch möglich, die Flaggen selber zu setzen Die Normalisierung wird zur Standardisierung der Werte benutzt. Dabei wird der höchste Wert gleich eins gesetzt und der niedrigste gleich null. Sie ist eine Art Kalibrierung und ein typisches statistische Verfahren.

7 Medianwert der feature- Pixelintensität der Wellenlänge #2, λ= 635 nm (rot) Medianwert = Bezeichnung für ein Messergebnis, dessen zugrundeliegende Messwerte mit gleicher Häufigkeit Unter- und Überschreitungen aufweisen; er entspricht daher nicht dem arithmetischen Mittelwert (=„mean“). Von extremen Abweichungen nach oben und unten wird er nicht beeinflusst und deshalb für das Gesamtergebnis herangezogen. Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität bei λ= 635 nm Arithmetischer Mittelwert der Hintergrund- Pixelintensität bei λ= 635 nm Standardabweichung der Hintergrund- Pixelintensität bei λ= 635 nm Prozent der feature- Pixel mit Intensitäten, die eine Standardabweichung größer sind als die Hintergrund- Pixelintensität bei λ= 635 nm Prozent der gesättigten feature- Pixel bei λ= 635 nm „standard deviation“: Standardabweichung der feature- Pixelintensität bei λ= 635 nm Arithmetisches Mittel = Durchschnittswert, der aus der Summe einer Anzahl von Zahlen, dividiert durch ihre Anzahl, entsteht; das arithmetische Mittel von 5, 8 und 11 z. B. ist (5 + 8 + 11): 3 = 8. Dieser Wert wird von extremen Abweichungen nach oben und unten sehr beeinflusst und wird zur Beurteilung der Streuung herangezogen. Die Messung der feature- und Hintergrund- Pixelintensitäten für die Wellenlänge #1, λ= 532 nm (grün) ist analog Arithmetischer Mittelwert der feature- Pixelintensität bei λ= 635 nm Medianwert der feature- Pixelintensität bei λ= 635 nm D.h.: Der Wert gibt an, wieviel Prozent der Pixel außerhalb der Standardabweichung liegen und somit statistisch interessant werden. Noch signifikanter für die Statistik sind die Werte mit zweifach abgezogener Standardabweichung. Prozent der feature- Pixel mit Intensitäten, die zwei Standardabweichung größer sind als die Hintergrund- Pixelintensität bei λ= 635 nm Dies ist ein Wert zur Fehleranalyse. Er muss null sein.

8 Das Verhältnis der Mittelwerte: Hier werden die arithmetischen Mittel ins Verhältnis gesetzt. Dazu wird von jeder einzelnen feature- Pixelintensität der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität abgezogen. Von den gesamten Pixelintensitäten eines features wird der Mittelwert genommen und ins Verhältnis zum Mittelwert der anderen Wellenlänge gesetzt. Es gilt also: Die Summe aller feature- Pixelintensitäten bei λ= 635 nm Die Summe aller feature- Pixelintensitäten bei λ= 532 nm Signal to Noise Ratio bei λ= 635 nm Signal to Noise Ratio ist definiert als das Verhältnis zwischen der Intensität des Signals eines features und der Abweichung im Hintergrund (= „Hintergrundgeräusch“ = the „noise“). Letzteres entspricht der Standardabweichung der Hintergrund- Pixelintensität. Für die Intensität des Signals wird der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität von dem Medianwert der feature- Pixelintensität abgezogen. Für λ= 635 nm (als Bsp.) gilt also: SNR 635 = (F635 Median – B635 Median) / B635 SD Je kleiner die Standardabweichung, desto glaubhafter die Beurteilung des Signals! Signal to Noise Ratio bei λ= 532 nm „Ratio“ = Verhältnis: Jedes feature eines Bildes setzt sich aus vielen Pixeln zusammen. Es wird eine Methode benötigt, um eine repräsentative Intensität für jedes feature anzugeben. Dafür wird das Verhältnis berechnet: es werden die Pixelintensitäten der beiden Wellenlängen ins Verhältnis gesetzt. Dabei wird jeweils die Hintergrund- Pixelintensität von der feature- Pixelintensität einer Wellenlänge abgezogen. In GenePix Pro wird angenommen bzw. festgelegt, dass bei diesen Berechnungen die Wellenlänge #2 (635 nm) immer im Zähler steht; Wellenlänge #1 (532 nm) steht im Nenner. Das Verhältnis der Medianwerte: Von dem Medianwert der feature- Pixelintensität ist jeweils der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität für jede Wellenlänge abgezogen. Es gilt also: I P, λ k = Intensität eines einzelnen feature- Pixels bei der Wellenlänge k I B, λ k = Intensität eines einzelnen Hintergrund- Pixels bei der Wellenlänge k n = Anzahl der feature- Pixel m = Anzahl der Pixel Hintergrund- Pixel Obwohl hier das arithmetische Mittel berechnet wird, wird der Medianwert der Hintergrundpixel benutzt, da dieser nicht durch extrem abweichende Werte verfälscht wird.

9 Bei „Median of Ratios“ wird jedes einzelne Pixel der beiden Wellenlängen ins Verhältnis gesetzt. Dabei wird wie immer jeweils die mediane Hintergrund- Pixelintensität abgezogen. Erst am Ende wird der Medianwert genommen. Das heißt, tendenzielle Abweichungen einzelner Pixel sowohl bei roter als auch bei grüner Wellenlänge mitteln sich raus und fallen somit nicht ins Gewicht. Es gilt: Für „Mean of Ratios“ gilt dasselbe wie für „Median of Ratios“. Im Unterschied wird hier zum Schluss der Mittelwert gezogen. Es gilt also: Standardabweichung der ratio- Pixelintensität Regression Ratio: Die Werte geben die Steigung einer Ausgleichsgerade an, die zu allen Pixeln den minimalsten Abstand aufweist. Für jedes feature werden die Pixel in einem zweimal so großen Kreis wie das feature selber um dieses herum berückichtigt. Regression R²: Es ist ein Wert für die Güte der Ausgleichsgerade, ein sogenanntes Bestimmtheitsmaß. Er gibt an wie stark die Pixel um die Gerade herum gestreut sind. Bei Rgn R²=0 liegen alle Pixel auf der Geraden. Der Logarithmus der Ratio wird berechnet, um aus exponentiellen Funktionen lineare zu machen

10 Der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität wird vom Medianwert der feature- Pixelintensität abgezogen. Der Wert gibt die Leuchtintesität der Probe für die jeweilige Wellenlänge wider. Der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität wird vom Mittelwert der feature- Pixelintensität abgezogen. Der Wert gibt die Leuchtintesität der Probe für die jeweilige Wellenlänge wider, wobei hier auch einzelne leuchtintensivere Pixel herausstechen. Hier werden der Median- bzw. der Mittelwert mit den abgezogenen Hintergrund- Pixelintensitäten beider Wellenlängen addiert. Werden in dem Bild beide Wellenlängen übereinander gelegt, gibt uns dieser Wert die Lichtintensität der Probe wider. Summe aller gemessenen Pixel des Hintergrundes bzw. des features in dem jeweiligen Meßbereich