Chemisch-Analytische Methoden in der Pflanzenphysiologie Qualitative Analytik nennt man Nachweis Aufgabe der (Bio)Chemischen Analytik ist die quantitative Bestimmung von Stoffen (Analyten) Spurenanalytik (Kleinstmengenanalyse) Test (halbquantitative Analyse)

Verfahren, Methode, Prinzip Unter- suchungs- Objekt Proben- nahme Vor- bereitung Messung Aus- wertung Analytische Information Prinzip Analysemethode Analyseverfahren

Kriterien zur Beurteilung einer Methode Spezifität (Selektivität) Empfindlichkeit (Nachweisgrenzen) Genauigkeit & Reproduzierbarkeit (accuracy & precision)

Selektivität Selektivität hängt von möglichen Störungen durch andere Probe-Inhaltsstoffe ab. Abtrennung von störenden Stoffen spezifischere Methoden Begriff: Matrix!

Empfindlichkeit S = m.c + SL Nachweisgrenze: N = SL + 3.StabL Fähigkeit der Methode zwischen kleinen Differenzen in der Konzentration des Analyten zu unterscheiden abhängig von der Steigung der Kalibrationsgeraden Nachweisgrenze: S = m.c + SL N = SL + 3.StabL

Genauigkeit & Reproduzierbarkeit Genauigkeit (accuracy) sagt aus, wie nahe ein Meßwert dem tatsächlichen Wert kommt Reproduzierbarkeit (precision) sagt aus wie übereinstimmend wiederholte Messungen sind

Systematischer & Zufälliger Fehler gut schlecht Systematischer Fehler gut schlecht Genauigkeit Reproduzier- barkeit optimal

Die Kalibration Prozess, mit welchem man die Gerätewerte mit den absoluten Mengen der zu bestimmenden Substanz in Übereinstimmung bringt. Leerwerte (blanks) Standards (externe, interne) Kalibrationsbereich Kontrollen

Leerwerte Leerwert ist Matrix ohne Analyt Nullpunktbestimmung für jedes analytische Gerät notwendig Man unterscheidet: - Reagenzienleerwerte (z.B. Photometrie) - Blindwerte (Grundwert, z.B. Enzymatik)

Standards Proben bekannter Konzentration, die man zur Kalibrierung einer Methode einsetzt, nennt man Standards! Standards sollten in Matrix hergestellt sein. Externe Standards: die zu bestimmende Substanz wird chemisch rein eingesetzt Interne Standards: eine ähnliche Substanz, die man zusetzt und die als Bezugsgröße verwendet wird

Kalibrationskurve Kalibrations- punkte Nichtlineare Kalibrationskurve Arbeitsbereich Nichtlineare Kalibrationskurve

Kalibration 1. Leerwert 2. Standards 3. Proben M + R Messung Instrumenten- Auf Null stellen Anzeige 2. Standards S1 + M + R Messung Instrumenten- Kalibrations- S2 + M + R Anzeige kurve 3. Proben P1 + M + R Messung Instrumenten- Werte- P2 + M + R Anzeige berechnung M, Matrix; R, Reagentien; S1, Standard 1; P1, Probe 1.

Kontrollen Um eine Methode zu überprüfen sollte regelmäßig eine Probe bekannter Konzentration gemessen werden. Biologische Referenzmaterialien Schwierig bei Methoden die keine pool-Größen messen, sondern Prozesse (etwa Enzymaktivitäten)

Berechnungen 1: Konzentrationen Masse (kg) c = m / v (Konzentration = Masse / Volumen) z.B.: mg L-1, µg cm-3, mg mL-1, etc Stoffmenge (Mol) c = n / v (molare Konzentration = Mol / Volumen) z.B.: mol L-1 (M), mmol L-1 (mM), µmol mL-1 (mM), µmol L-1 (µM)

Berechnungen 2: Verdünnungen ! das Produkt aus Konzentration mal Volumen vor der Verdünnung entspricht dem Produkt nach der Verdünnung! Cvor x Vvor = Cnach x Vnach z.B.: Aus einer 1M KCl-Lösung soll 250 mL einer 20mM Lösung hergestellt werden. 1M x X = 0.02M x 250 mL X = (0.02 x 250) / 1 = 5 mL Lösung: 5 mL einer 1M KCl sind notwendig um 250 mL einer 20 mM Lösung herzustellen

Berechnungen 3: Verdünnungsfaktor Z.B.: 10-fache Verdünnung (1 zu 10, 1:10) 1 mL auf 10 mL bedeutet 1 mL + 9 mL oder 1 mL in einem Gesamtvolumen von 10 mL Mischt man also gleiche Volumina miteinander hat man eine Verdünnung von 1:2 (nicht 1:1!).

Werteangaben (signifikante Stellen) Beispiel: Waage zeigt 0.0256 g an. Die letzte Stelle ist unsicher! Der wahre Wert kann also zwischen 25.55 und 25.64 mg liegen.

Werteangaben 2 Beispiel: Meßwerte — 11.44 mg Calcium, 2.11 g Pflanzenmaterial 11.44 2.11 11.435 - 11.444 2.105 - 2.114 5.4366 5.4092 Jeder Wert zwischen 5.409 und 5.437 ist möglich. Der Wert kann also nicht als 5.42 angegeben werden (Grenzwerte 5.415-5.424), sondern nur als 5.4 mg g-1 (Grenzwert 5.35 und 5.44).

Praktische Hinweise Chemikalien Wasserqualitäten Wägen Zentrifugation Volumsmessungen

Chemikalien Gefahrensymbole Qualitäten p.a. (pro analysis), zur Synthese, ACS, OEAB, chemisch rein, Suprapur, Biochimica select Beschriftungen von abgefüllten Chemikalien Inhalt, Konzentration, Datum, Benutzer Giftig Mindergiftig Ätzend Explosions- Brand- Hoch/Leicht Reizend gefährlich fördernd Entzündlich

Chemikalien

Wasserqualitäten Demineralisiertes Wasser Geschirrspüler (Reversosmose, Hausleitung) Deionisiertes Wasser Abwaschen, (Ionentaustauscherpatrone, allg. Labor) anorg. Analytik Destilliertes Wasser Enzymaktivitäten (Quarzdestillationsanlage) Milli Q-Wasser Reinstwasser, (Reinstwasser >18.2 MOhm cm-1) Chromatographie

WÄGEN Wägebereich der Waage beachten! Störungen: Offene Türen, Heizung, Erschütterungen Nivellieren (Libelle) und Kalibrieren (Auto) Wägegefäß sollte möglich klein sein Statische Aufladungen vermeiden (kein Kunststoff) Mitte der Waagschale (Ecklasteffekt) Waage vorbelasten (Erstwägeeffekt) Indirekte Handhabung (Zange; T- und RH-Effekte) Wägegut sollte Umgebungstemperatur haben

Einflüsse beim Wägen Temperatur Luftfeuchte T+ T- Wägegut erscheint leichter Wägegut erscheint schwerer Verdunstung erscheint leichter Wasseraufnahme erscheint schwerer

Zentrifugation Relative Beschleunigung (x g) statt Drehzahl (rpm) Max. Drehzahl beachten Bremsen (je nach An- wendung) Austarieren der Gefäße Beladung: - 2 x gegenüber (180°) - 3 x im Winkel 120°

Volumsmessung (auf Wägungen zurückführbar) Glaspipetten (Ex, 20°, ± 1%) Voll-, Meß-, Präszisionspipetten Luftpolsterpipetten Meßzylinder Büretten Dispensoren Meßkolben (In!) Enghals, Weithals