Praktikum Proteinchemie Meike Flentje und Julia Schwab 17.05.2013 SDS-PAGE Praktikum Proteinchemie Meike Flentje und Julia Schwab 17.05.2013

Meike Flentje & Julia Schwab Inhalt Theorie Einleitung SDS-PAGE SDS-PAGE Probenvorbereitung Coomassie Gelfärbung Versuchsdurchführung Ergebnisse Literatur SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab [1]

Meike Flentje & Julia Schwab Einleitung Ziel: Produktion und Aufreinigung von dem Protein FGF-2 Es handelt sich um einen Wachstumsfaktor Dieser bindet an den FGF-2 Rezeptor und führt zur Dimerisierung SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab [2]

Meike Flentje & Julia Schwab SDS-PAGE Eindimensionale Auftrennungsmethode nach der Größe Diskontinuirliches Tris-HCL / Tris-Glycin Puffersystem Sammelgel: weitporig , pH 6,8 und geringere Pufferstärke sowie Stapelung der Proteine Glycin: Folge-Ion wegen geringer Mobilität Chlorid: Leit-Ion wegen hoher Mobilität SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

Meike Flentje & Julia Schwab SDS-PAGE Trenngel: pH 8,8 sowie eng porig und damit erfahren die Proteine einen höheren Reibungswiderstand Folge: bessere Auftrennung und schärfere Banden [3] SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

SDS-PAGE Probenvorbereitung Red. Laufpuffer mit einem Überschuss an SDS Erwärmung der Proben auf 95 °C Denaturierung DTT spaltet die Disulfidbrücken SDS kann sich anlagern und eine negative Mizelle bilden, damit werden Eigenladungen abgeschirmt -> Gesamtladung ist proportional zur Proteingröße [4] SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

Meike Flentje & Julia Schwab Coomassie Gelfärbung Farbmittel: Coomassie Brillant Blue R-250 Unspezifische Proteinfärbung Interaktion mit den basischen Resten, damit werden Lysin, Arginin und Histidin detektiert SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

Versuchsdurchführung Gel gießen Probenvorbereitung Proben auftragen Gellauf Coomassie Färbung SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

Meike Flentje & Julia Schwab Ergebnisse Abb. 3: : 14: 34 h (A) (7 µL); 15-20: 34 h-44 h (B) (7 µL); 21: 46 h (A) (7 µL); M: Protein-Marker (3 µL); 22: Gesamtzellprotein (A) (7 µL); 23: lösliche Proteine (A) (7 µL); 24: unlösliche Proteine (A) (7 µL); 25: Gesamtzellprotein (B) (7 µL); 26: lösliche Proteine (B) (7 µL); 27: unlösliche Proteine (B) (7 µL) Abb. : SDS-PAGE nach der Kultivierung: 1: Vorkultur (A) (7 μL); 2-7: 12 h-22 h (B) (7 μL); 8-13: 22 h-32 h (A) (7 μL); M: Protein-Marker (3 μL) SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

Meike Flentje & Julia Schwab Ergebnisse Abb. 4: SDS-PAGE nach der Kationenaustausch-Membran-Chromatographie: Probe 1-23 (10 μL); M: Protein-Marker (3 μL) SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

Meike Flentje & Julia Schwab Ergebnisse Abb. 5: SDS-PAGE nach der Heparin-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie: M: Protein-Marker (3 μL); 1-16: Probe (10 μL) SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

Meike Flentje & Julia Schwab Ergebnisse Abb. 6: Zusammenfassung der Ergebnisse: 1: Gesamtzellprotein (B) (10 μL); 2: lösliche Proteine (B) (10 μL); 3: unlösliche Proteine (B) (10 μL); M: Protein-Marker (4 μL); 4-5: Heparin-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie K + M (15 μL) SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

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Meike Flentje & Julia Schwab Literatur [1] Atherton, B. A.; Cunningham, E. L.; Splittgerber, A. G.: A mathematical model for the descrip-tion of the Coomassie brilliant blue protein assay. In: Anal Biochem. 233(2), S. 160-8 (1996). [2] Fazekas de St. Groth, S.; Webster, R. G.; Datyner, A.: Two new staining procedures for quantit-ative estimation of proteins on electrophoretic strips. In: Biochimica et Biophysica Acta. 71, S. 377–391 (1963). [3] Laemmli, U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4. In: Nature. 227, S. 680-685 (1970). [4] Lottspeich, H.; Zorbas, H.: Bioanalytik. 1. Aufl. Heidelberg: Spektrum, Akad. Verl. (1998). [5] Reinard, T.: Molekularbiologische Methoden. 1. Aufl. Stuttgart: Eugen Ulmer KG. (2010). SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

Meike Flentje & Julia Schwab Literatur - Bild Bild 1: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Protein_FGF2_PDB_1bas.png; 28.05.2013 Bild 2: http://www.pnas.org/content/96/7/3658/F2.expansion.html; 28.05.2013 Bild 3: https://www.goldbio.com/FGF2-Basic-FGF-Human-P5983-C241.php; 28.05.2013 Bild 4: http://www.bio-rad.com/evportal/en/US/LSR/Solutions/LUSOW4GRI/Protein-Electrophoresis-Methods; 28.05.2013 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab