GDL-Symposium: Hydrokolloide VII 23.-24. April 2012, Bremerhaven Reaktivität und innovative Applikationen von Chitosan im Lebensmittelbereich Klaus Lösche ttz Bremerhaven

Chitin und Chitosan Chitin ist ein Poly-ß-1,4 –N-acetyl-Glucosamin (poly-GlcNac) Biologische Funktion: Festigkeit, Schutz u.a gegen Frassfeinde Vorkommen: Exoskellett von Insekten und Crustacea, Zellwände von Hefen und Schimmelpilzen (inkl. höhere Pilze) ; bis zu 30-60 % Anteile) Chitin ist ein fibrilläres Material in biologischen Komposite Strukturen (Ausnahme: Diatomea), vergesellschaftet mit Proteinen (Matrix), Polyphenolen (Insekten), Mineralien (primär Ca-Carbonat / Calcit in Crustacea)… Chitin ist in 12 Mol/l kalte HCl löslich oder in LiCl / Dimethylacetamid (analog Cellulose), Chitosan solubilisiert in schwachen Säuren… Nachwachsender, bioabbaubarer Rohstoff: ca. 1000 Mrd. t Chitin-Synthese / Jahr (weltweit), vor Cellulose bedeutendster Rohstoffe (mengenmäßig) Zulassung als Lebensmittelzusatzstoff in Japan : seit 1993

Chitosan: ß-1,4 –Polymer des Glucosamin 2-Amino-2 –Desoxy-ß-D-Glucose N-Acetyl -Glucosamin N-Acetyl-glucosamin β -1,4-Glucan

Chitin -Quellen Crawfish/Crabs Fungi Shrimp Composition (Based upon Dry Weight)  Chitin 25-30% 30-40 15-40%  Protein 15% 35% 5-10%  CaCO3 55% 30% Glycans  Lipids 2-5% 5-10% 5-10% Astaxanthin pigment!

Simplified flowsheet for preparation of chitin, chitosan, their oligomers and monomers from shellfish waste Quelle: F. Shahidi et al. / Trends in Food Science & Technology 10 (1999)

Verfahrensschritte zur chemischen und biochemischen (enzymatischen) Herstellung von Chitosan Chemisches Verfahren Zellmaterial Enzymatisches Verfahren Deproteinierung (Natronlauge) Deproteinierung (Proteasen) Demineralisierung (Salzsäure) Demineralisierung (organische Säuren) Chitin Deacetylierung (Natronlauge) Deacetylierung (Deacetylasen) Chitosan

Wichtige Eigenschaften von Chitin bzw Wichtige Eigenschaften von Chitin bzw. Chitosan im Hinblick auf medizinische, pharmazeutische und kosmetische Anwendungen Eigenschaften Chitin Chitosan biologisch abbaubar Ja antibakteriell hydratisierbar Derivatisierbar Allergen Nein Nein (?) Toxisch Sehr gering Bindung von Gallensäuren

Chitosan-Nutzung: Prozentuale Verteilung; Heras et al. 2009

Chemical Properties of Chitosan Cationic polyamine with low pKa High charge density at pH’s below 6.5 Adheres to negatively charged surfaces Forms gels with polyanions Chelates transition metals Amenable to Chemical Modification Both amino and hydroxyl groups can be selectively modified

N-Carboxymethyl Chitosan (NCMC) Water soluble, Efficient metal chelator

Hydroxypropyl Trimethylammonium Chitosan Chloride (ChitoQuat) Manuzak, Macossay, Logan U. S. Patent 6,306,835 D.S. ~ 1 Water soluble from pH 1 - pH 12, Insensitive to salts High biocidal activity E. coli St. Aureus P. aeruginosa MIC, (g/mL) 32

CMChitosan Quats Monoquat E coli MIC > 128 mg/mL Diquat

Effective Antimicrobial Fiber Blends C-W. Nam, Y-H. Kim, S-W, Ko, J Appl. Polym. Sci., 74, 2258-65 (1999) 0.5 wt% ChitQuat reduced Staph activity by 90% Blends exhibit excellent laundering durability and antistatic properties

Chitosan: Reaktivität / Charakterisierung >50% Deacetylierungsgrad (des Chitins) In 1%iger Essigsäure solubilisierbar (Chitin ist unlöslich) Viskosität: 200 – 2000 mPas kommerzielle Chitosan-Präparate i.d.R. >85% deacetyliert Molmassen : 100 kDa - 1000 kDa (komplexiert oft mit Säuren wie Essigsäure, Milchsäure) Positive Ladung in saurer Lösung: Chit-NH2 +H2O ⇌ Chit –NH3⊕ + H2O pKa –Wert = ca. 6,3 Chitosan solubilisiert , wenn > 50% der Aminogruppen protonisiert vorliegen Löslichkeit stark abnehmend oberhalb von pH 6,0 -6,5 Max. lösliche Konzentration ist abhängig vom Chitosan-Typ : i.d.R. 10-20 g / l Chitosan Chitosan ist filmbildend , daher geeignet für Gele und Coatings

Chitosan: Antimikrobielle Aktivität Abhängig von: Chitosan-Typ, Ziel-Organismus, Randbedingungen (pH-Wert etc.) Hefen>Schimmelpilze> Gram-positive Bakterien>Gram-negative Bakterien Sacch. cereviseae –Fermentation durch 3,6 mg / l Chitosan inhibiert Stopp des Wachstums von Fusarium solani durch 4 mg / l Chitosan Wirkung von Molmasse abhängig : < 10kDa Chitosan ist aktiver als natives Chitosan (degree of polymerization : min 7) Je höher der Deacetylierungsgrad umso wirksamer antimikrobielle Effekte… (analog dem Anstieg der Löslichkeit bzw. dem Anstieg der elektrischen Ladung) Saure pH-Werte verstärken die antimikrobielle Wirkung ( Hürden-Effekte) Hohe Temperatur ( z.B. +37 °C) wirksamer als niedrige (z.B. +4 °C) Matrix-Effekte (großer Einfluss): Chitosan bindet viele Lebensmittel-Bestandteile wie Alginate, Pektine, Proteine, anorg. Phosphate (Polyphosphate), anorg. Polyelektrolyte, kleine Elektrolyte wie NaCl, Ca-Salze, Na-Phosphate , ionische Emulgatoren (Lecithin, DAWE ), etc.

Global player Chitin/Chitosan Glucosamin Advanced Biopolymers AS (Norway) Biothera, Inc. (Formerly Biopolymer Engineering) (USA) CarboMer, Inc. Speciality Chemicals. (USA) Dalian Xindie Chitin Co. Ltd. (China) Kunpoong Bio Co., Ltd. (South Korea) 200 t/a Meron Biopolymers (India) Navamedic ASA (Norway) Glucosamin Primex Ehf (Iceland) Sonat. Co (Russia) 50 t/a Taizhou Candorly Sea Biochemical & Health Products Co., Ltd.(China) United Chitotechnologies, Inc. (USA) größere Produktion HaloSource, Inc (USA), Wasseraufbereitung, Geruchsbindung V-Labs, Inc. (USA), Carbohydrates Cognis (BASF); Germany

Food applications of chitin, chitosan and their derivatives in the food industry Area of application Examples Antimicrobial agent Bactericidal Fungicidal Measure of mold contamination in agricultural commodities Edible film industry Controlled moisture transfer between food and surrounding environment Controlled release of antimicrobial substances Controlled release of antioxidants Controlled release of nutrients, flavours and drugs Reduction of oxygen partial pressure Controlled rate of respiration Temperature control Controlled enzymatic browning in fruits Reverse osmosis membranes Additive Clarification and deacidifiication of fruits and beverages Natural flavour extender Texture controlling agent Emulsifying agent Food mimetic Thickening and stabilizing agent Colour stabilization Nutritional quality Dietary fibre Hypocholesterolemic effect Livestock and fish feed additive Reduction of lipid absorption Production of single cell protein Antigastritis agent Infant feed ingredient Recovery of solid materials Affinity flocculation from food processing wastes Fractionation of agar Purification of water Recovery of metal ions, pesticides, phenols and PCB's Removal of dyes Other applications Enzyme immobilization Encapsulation of nutraceuticals Chromatography Analytical reagents Quelle: F. Shahidi et al. / Trends in Food Science & Technology 10 (1999)

Effects of Dietary Fibers on Fecal Lipid Excretion % Fat Excreted Chitosan 50.8+21.6 Carrageen 9.6+1.9 Kapok 8.3+1.1 Sodium Alginate 8.1+2.2 Pectin 7.1+1.9 Locust Bean 6.0+1.8 Guar 6.0+1.7 Konjak 5.2+0.6 Cellulose 5.1+2.1 Karaya 4.9+1.5 Chitin 4.3+1.0 Agar 2.8+0.4 Effects of Dietary Fibers on Fecal Lipid Excretion (McCausland CW. 1995, Deuchi K. 1994)

Gelbildende und nicht gelbildende Hydrokolloide Neutral Verdickungsmittel - Guar - Johannisbrotkernmehl - etc. Anionisch Gelbildner Alginat - Xanthan - Carrageen - Stärke - modifizierte Cellulose - etc. Kationisch Gelbildner - Chitosan - amidierte Pektine Abb.: Differenzierung der Hydrokolloide nach ihrem Ladungssinn

Hydrogele Lösungen aus Makromolekülen durch pH-, Temperatur- oder inotrop-induzierte Gelierung Inotroper Gelbildung-Mechanismus Reaktion eines Polyelektrolyten mit entsprechenden Gegenionen (Ca2+, K⊕, Cu2+ …) Beispiel: - Gelatine, Agarase, Chitosan (bevorzugt Gelbildung durch Temperatur-Erhöhung sowie Cellulosederivate wie Chitosan) - Koazervation: Polyelektrolyt – Polyelektrolyt-Komplexe (Symplexgele) Beispiel: Cellulosesulfate mit Poly(dimethyl diallyl) ammoniumchlorid Chitosan  Molke z. B. feste Gele (Gelatine-Substitut), Folien… Chitosan  Schellack z. B. filmbildend, Verpackungsfolien Chitosan  Gliadin z. B. filmbildend, Verpackungsfolien Chitosan  Polyphosphat z. B. gelartige Emulsionsstabilisierung (z.B. Fleisch) Chitosan  Alginat z. B. Mikroverkapselung

Stabilisierung von Schäumen Interaktion zwischen teilweise- entpolymerisiertem Chitosan und Molkeprotein Interaktion zwischen Chitosan und Molkeprotein Abb.: Funktion von mikrokristallinem Chitosan

Colloidal charge as a function of chitosan dose for emulsions with different interfacial areas obtained with different agitation times: (□) 3-75 min; () 7-´5 min; and (+) 15 min. Quelle: Journal of Food Engineering 32 ( 1997) p. 69-81

Einschluss von konventionellen oder probiotischen Bakterien in Alginatmikrokapseln durch Vertropfung Druck/ Pumpe Vibrations- Düse Produkt Na-Alginat-lösung Bakterien-partikel Ca2+ Fäll- Bad Quelle: de Vrese et. al. 2007

Einschluss von Probiotika in Multilayer- Mikrokapseln aus Fettkern und Alginathülle Hartfett Probiotika Lyophilisat Beschichtungsbäder Chitosan (+) Alginat (-) Vibrationsdüse große runde Partikel (Kälte) Fällbad Quelle: de Vrese et. al. 2007

Untersuchung eines mehrschichtigen Kapselaufbaus durch Messung der Oberflächenladung der Partikel Quelle: de Vrese et. al. 2007

“Particle Charge Detection” (PCD) (in Aqua bidest.)” 6350 Coulomb/g -0,58 Witepsol H 37 + Chitosan (0,5%Tween 80) -2828 Quelle: de Vrese et. al. 2007 de Vrese et. al. 2007

Schmelzen von Chitosan-Alginat- beschichteten Hartfett-Mikropartikeln Feste Partikel Erweichen geschmolzen Quelle: de Vrese et. al. 2007

Chitosan Vernetzungsreaktionen, Transglutaminase-Katalyse mit Protein R-Glu-CO-NH2 + H2N-Chitosan R-Glu-CO-NH-Chitosan+NH3 Beispiel: Kreuzvernetzungen Molkenproteine Milchproteine Emulsionsstabilisierung Soja-Proteine Coating von Proteinfilmen Myosin, Actin Überzüge von Proteinhaltigen Lebensmitteln Weizenkleber Anti-Allergikum Seide anderes anderes

Künstliche Zellen: Nano-Reaktor Glucose-1- phosphat Phosphat Phosphorylase Stärke “Wand” des Koazervattröpfchens Amylase Starch Maltose Glucose-1- phosphat Phosphat Phosphorylase

Permeabilitäten von Chitosan-Membranen und von Cellophan Dicke µm Permeabilität für Wasser (g∙m-2 ∙ 24 h -1)a O2 N2 (ml∙m-2 ∙ 24 h -1)b CO2 Chitosan 20 1200 3.6 0.7 2.7 Cellophan 22 11.3 3.7 264.0 Bei 90% rel. Luftfeuchtigkeit und 37,8°C bei 21°C und 760 mm Hg

Coatings Coating layer Volatile compounds aroma Functional ingredients can be incorporated in coatings Antioxidants Antimicrobials Nutraceuticals Flavors Colorants Fresh produce (Water, Carbohydrate, Proteins, Pigments, Aroma) Gases O2/CO2/Ethylene Moisture Figure 1: Functional properties of an edible coating on fresh fruits and vegetables

Examples of edible coating applications on fruits and vegetables that have been investigated Commodity Coating material Primary functions References Apple Caseinate; whey protein O2 barrier; carrier (antioxidant) Le Tien and others (2001) Apple (fresh-cut) HPMC Alginate; gelatin, CMC Polysaccharide/lipid bilayer Zein Wax; shellac Carrageenan; WPC WPI-BW emulsion WPI; WPC, HPMC; wax O2/H2O barrier O2/CO2/H2O barrier O2/CO2barrier, gloss O2/CO2/H2O barrier, gloss O2/CO2 barrier O2/H2O barrier O2 barrier Cisneros-Zevallos and Krochta (2003) Moldao-Martins and others (2003) Wong and others (1994a, 1994b) Bai and others (2003a) Bai and others (2003b) Lee and others (2003) Perez-Gago and others (2003b) Perez-Gago and others (2005) Avocado Methylcellulose O2/CO2/H2O barrier Maftoonazad and Ramaswamy (2005) Carrot (peeled) Xanthan gum Calcium caseinate; WPI; pectin; CMC Alginate H2O barrier; Ca2+, Vit. E carrier H2O barrier H2O barrier; microbial barrier Mei and others (2002) Lafortune and others (2005) Amanatidou and others (2000) Celery Caseinate O2/CO2/H2O barrier; carrier (antimicrobial) Avena-Bustillos and others (1997) Cherry SemperfreshTM Caseinate; milk protein O2/H2O barrier O2/CO2/H2O barrier Yaman and Bayoindirli (2002) Certel and others (2004) Corn Zein Microbial barrier Carlin and others (2001) Green bell pepper Lipid-based Conforti and Ball (2002) Conforti and Zinck (2002) Kiwifruit Pullulan (bacterial polysaccharide from starch) Diab and others (2001) Lettuce Alginate-based Tay and Perera (2004)

Examples of edible coating applications on fruits and vegetables that have been investigated Commodity Coating material Primary functions References Litchi fruit (peeled) Chitosan Chitosan O2/H2O barrier O2 barrier Dong and others (2004) Jiang and others (2005) Mango fruit Wax; shellac; zein; cellulose derivative O2/CO2/H2O barrier Hoa and others (2002) Mushroom Alginate O2/H2O barrier Hershko and Nussinovitch (1998) Citrus Chitosan Fornes and others (2005) Peach Wax; CMC H2O barrier Togrul and Arslan (2004) Pear (cut wedges) Methylcellulose-based Methylcellulose O2/CO2/H2O barrier, carrier (antioxidant) O2/CO2/H2O barrier Guadalupe and others (2003) Olivas and others (2003) Plum HPMC/lipid composite Perez-Gago and others (2003a) Potato Caseinate; whey protein O2 barrier; carrier (antioxidant) Le Tien and others (2001) Quince SemperfreshTM Yurdugül (2005) Raspberry H2O barrier; Ca2+, Vit. E carrier Han and others (2004b) Strawberry Cactus mucilage Caselnate-whey protein Chitosan Chitosan; HPMC Pullulan (bacterial polysaccharide from starch) Starch-based Wheat gluten-based O2 barrier microbial barrier H2O barrier, Ca2+; Vtl. E. carrier H2O barrier; carrier (antimicrobial) O2/CO2/H2O barrier H2O barrier, carrier (antimicrobial) O2/H2O barrier Del-Valle and others (2005) Vachon and others (2003) Han and others (2004a, 2004b) Park and others (2005) Diab and others (2001) Garcia and others (1998) Tanada-Palmu and Grosso (2005) Water chestnut (fresh-cut) O2 barrier Pen and Jiang (2003) Zucchini Kaynas and Ozelkok (1999)

Biokonservierung von Getreide-Saatgut durch Chitosan Ungeschütztes Getreidekorn (Saatgut) Chitosan-Coating Schimmelschutz durch pflanzl. Chitinasen Chitosan Induktion und Expression von Chitinasen Chitinase

Minimal inhibitory concentrations (MIC, ppm) of chitosan and derivatives for different bacterial cultures* Bacterial culture DD69 SC1 SC2 SBC Gram positive Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Bacillus cereus 100 1000 500 >2000 NT 200 Gram negative Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa Shigella dysenteriae Vibrio cholerae Aeromonas hydrophila YMI Aeromonas hydrophila CCRC 13881 Salmonella typhimurium 2000 *Symbols are: DD69Ð69% deacetylated chitosan; SCIÐSulphonated chitosanÐ0.63% S; SC2ÐSulphonated chitosanÐ13.03% S; SBC± Sulphobenzoyl chitosan; NTÐNot tested Data adapted from Chen et al. [2] Quelle: F. Shahidi et al. / Trends in Food Science & Technology 10 (1999)

Antibakterielle Aktivität von Chitosan in Abhängigkeit von pH-Wert und Chitosan-Charge (Tri Erny Dyahningtyas, 2010)

Einfluss eines Chitosan-Coating von Shrimp-Fleisch auf die Gesamtkeimzahl , S.typhimorium und E.coli u.a. bei Raumtemperatur

Orangensaft: Chitosan statt Pasteurisation Orange juices enriched with chitosan: Optimisation for extending the shelf-life Innovative Food Science and Emerging Technologies 10 (2009) 590–600 A. B. Martín-Diana 1, D. Rico 1, J.M. Barat 2, Catherine Barry-Ryan 1 a 2. Institute of Food Engineering for Development, Department of Food Technology, Universidad Politécnica, Camino de Vera s/n, 46022, Valencia, Spain 1. School of Food Science and Environmental Health, Dublin Institute of Technology (DIT), Cathal Brugha Street, Dublin 1, Ireland

Chitosan : Folienherstellung , essbare Coatings für Früchte mit antimikrobieller (antifungaler) Aktivität http://www.youtube.com/watch?v=Ia4gwKYAdh4&feature=youtube_gdata_player , 20.04.2012

Oxidation von Phenolen durch Polyphenol-Oxidase (PPO): Enzymatische Bräunungsreaktion Links: Kontroll-Versuch Apfelscheibe Rechts : Apfel mit Chitosan-Lösung behandelt (1 % Chitosan in 1%iger Essigsäure-Lösung)

Enzymatische Bräunungsreaktionen Enzymatische Bräunungsreaktion: Melanosis –Verlauf bei Shrimps (Courtesy of Dr. W.S. Otwell, University of Florida, 2005).

Die Affinität von Chitosan zu bivalenten Metall-Ionen („Irving-Wlliams –Order“): Cu 2+ > Cd 2+ > Pb 2+ , Ni 2+ > Co 2+ (Muzarelli & Delben 1992). Die Bindungs-Kapazität ist abhängig vom pH-Wert , der Ladung, Temperatur u.a.m. Int. J. Biol. Macromol., 1987, Voi 9, April

Chitosan : Chelatisierung von Kupfer führt u.a. zur Gelierung Kupfer-Sulfat (1%ige wässrige Lösung) in Chitosan-Lösung vertropfen (1% Chitosan gelöst in 1% iger Essigsäure)

Vereinfachter Mechanismus einer Hydroxylierung und Oxidation eines Diphenols durch Phenoloxidase Phenoloxidase ist ein Kupfer-Enzym

Effect of chitosan coating on polyphenoloxidase activity in fresh-cut mushroom during 15 days of storage at 4°C Quelle: Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, Vol. 58, No. 1, pp. 95-105

Improved preservation effects of litchi fruit by combining chitosan coating with ascorbic acid treatment during postharvest storage Dequan Sun1, Guobin Liang2, Jianghui Xie1, Xintao Lei1 and Yiwei Mo1* http://www.academicjournals.org/AJB African Journal of Biotechnology Vol. 9(22), pp. 3272-3279, 31 May, 2010

Irradiated chitosan treatment on storage life of papaya

Potential Markets for Chitinous Materials Waste Treatment: Metal chelating cationic flocculating agent Sewage effluents Metal finishing/electroplating wastes Paper mills Radioactive wastes Protein flocculation for feed market from: Rendering plants, Milk and Vegetable Processing Poultry/Egg processing Single Cell Protein Recovery EPA approved FDA/AAFCO approved

Beispiel Anwendung im Abwasserbereich Flockungsmittel Prozesswasserbehandlung Konkurrenz: PolyAcrylAmid Vorteil günstiger Preis Nachteil WGK: 2-3 DDA <80 Viskosität <250 Asche >3%

Effect of chitosan on reduction of solid materials from food processing wastes Chitosan amount Chitosan amount (mg/L discharge) Reduction of suspended solids (%) Reference Meat processinga Shrimp processingb Crawfish processing Cheese whey Poultry processingc Egg processingd Wheat germ agglutinin Vegetable processing Fruitcake processing 30 10 150 2.5-15 10-16 100-200 20 2 89 98 97 82-97 74 88 70-90 70 84-90 94 [29] [88] [30] [33] [11] [32] [28] a Packing waste water. b With anionic polymer. c Chiller discharge. d With cationic polymer. Quelle: F. Shahidi et al. / Trends in Food Science & Technology 10 (1999)

EU-Projekt Chitofood : Development of new innovative functional foods containing microcyristalline chitosan (Erbslöh 2003) / QLK1-2001-70508

EU-Projekt Chitofood : Development of new innovative functional foods containing microcyristalline chitosan (Erbslöh 2003) / QLK1-2001-70508

Adsorption behavior of iron (III) ions onto chitosan with pH at 20 °C in 5 hours in 10 mM Fe+3 solution

EU-Projekt Chitofood : Development of new innovative functional foods containing microcyristalline chitosan (Erbslöh 2003) / QLK1-2001-70508

Zusammenfassung und Schlussfolgerung Chitosan ist derzeit nicht als Zusatzstoff zugelassen (Deutschland) Die Reaktivität von Chitosan als kationisches Hydrokolloid ist spezifisch: - filmbildend, gelbildend (ionotrope Gelierung) - chelatisierend, antioxidativ - antimikrobiell - Elicitor, Induktor - anderes Die Anwendungspotentiale sind dementsprechend pluripotent und geeignet neuartige Potentiale im Lebensmittelbereich zu generieren.

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Bäckerei- und Getreidetechnologie Klaus Lösche ttz Bremerhaven Am Lunedeich 12 27572 Bremerhaven Tel. : +49 471 97297-0 Fax.: +49 471 97297-22