V12 Stochastische Simulation zellulärer Signalprozesse Traditionelle numerische Ansätze für chemische/biochemische Kinetik: (a) beginne mit einem Satz von gekoppelten gewöhnlichen Differentialgleichungen (für die Reaktionsraten), die die zeitliche Entwicklung der Konzentrationen der beteiligten chemischen Stoffe angeben, (b) verwende einen geeigneten Integrationsalgorithmus um, basierend auf den Ratenkonstanten und einem Satz von Anfangsbedingungen, die Konzentrationen als Funktion der Zeit zu berechnen Erfolgreiche Anwendungen : für den Hefe Zellzyklus, metabolic engineering, Modelle der gesamten metabolischen Pfade (E-cell), ... Großes Problem: zelluläre Prozesse laufen in sehr kleinen Volumina ab und es ist oft nur eine sehr kleine Anzahl an Molekülen beteiligt. z.B. Interagieren bei der Genexpression einige wenige Transkriptionsfaktor-moleküle mit einer einzigen Gen-regulatorischen Region. E.coli Zellen enthalten nur etwa 10 Moleküle des Lac Repressors. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

berücksichtige stochastische Effekte (Konsequenz1)  die Modellierung der Reaktionen als kontinuierliche Flüsse von Substanzen ist nicht mehr korrekt. (Konsequenz2) Es können erhebliche stochastische Fluktuationen auftreten. Für die Untersuchung der stochastischen Effekte bei biochemischen Reaktionen werden stochastische Beschreibungen der chemischen Kinetik sowie Monte Carlo Computersimulationen benutzt. Daniel Gillespie (J Comput Phys 22, 403 (1976); J Chem Phys 81, 2340 (1977)) introduced the exact Dynamic Monte Carlo (DMC) method that connects the traditional chemical kinetics and stochastic approaches. Assuming that the system is well mixed, the rate constants appearing in these two methods are related. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Dynamic Monte Carlo In the usual implementation of DMC for kinetic simulations, each reaction is considered as an event and each event has an associated probability of occurring. The probability P(Ei) that a certain chemical reaction Ei takes place in a given time interval t is proportional to an effective rate constant k and to the number of chemical species that can take part in that event. E.g. the probability of the first-order reaction X  Y + Z would be k1Nx with Nx :number of species X, and k1 : rate constant of the reaction Similarly, the probability of the reverse second-order reaction Y + Z  X would be k2NYNZ. Resat et al., J.Phys.Chem. B 105, 11026 (2001) 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Dynamic Monte Carlo As the method is a probabilistic approach based on „events“, „reactions“ included in the DMC simulations do not have to be solely chemical reactions. Any process that can be associated with a probability can be included as an event in the DMC simulations. E.g. a substrate attaching to a solid surface can initiate a series of chemical reactions. One can split the modelling into the physical events of substrate arrival, of attaching the substrate, followed by the chemical reaction steps. Resat et al., J.Phys.Chem. B 105, 11026 (2001) 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Basic outline of the direct method of Gillespie (Step i) generate a list of the components/species and define the initial distribution at time t = 0. (Step ii) generate a list of possible events Ei (chemical reactions as well as physical processes). (Step iii) using the current component/species distribution, prepare a probability table P(Ei) of all the events that can take place. Compute the total probability P(Ei) : probability of event Ei . (Step iv) Pick two random numbers r1 and r2  [0...1] to decide which event E will occur next and the amount of time  by which E occurs later since the most recent event. Resat et al., J.Phys.Chem. B 105, 11026 (2001) 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Basic outline of the direct method of Gillespie Using the random number r1 and the probability table, the event E is determined by finding the event that satisfies the relation The second random number r2 is used to obtain the amount of time  between the reactions As the total probability of the events changes in time, the time step between occurring steps varies. Steps (iii) and (iv) are repeated at each step of the simulation. The necessary number of runs depends on the inherent noise of the system and on the desired statistical accuracy. Resat et al., J.Phys.Chem. B 105, 11026 (2001) 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Bacterial Photosynthesis 101 ATPase Photons Reaction Center chemical energy light energy e––H+–pairs outside inside Light Harvesting Complexes cytochrome bc1 complex ubiquinon cytochrome c2 electronic excitation H+ gradient; transmembrane potential electron carriers 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Modelling as metabolic network Chemical reactions involved: 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Photosynthesis – cycle view The conversion chain: stoichiometries must match turnovers! H+ gradient, transmembrane voltage electronic excitation chemical energy e––H+–pairs light energy electrons 2 cycles: protons outside inside 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

downhill Transport der Exzitonen LH1 / LH2 / RC — im Lehrbuch Photonen einfangen B800, B850, Car. LH2: 8 αβ Dimere downhill Transport der Exzitonen LH2  LH1 RC LH1: 16 αβ Dimere 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge Hu et al, 1998

Der Cytochrom bc1 Komplex Bekannte X-ray Structuren Berry, etal, 2004 bezeichnen stets einen Dimer. die “Protonenpumpe" Q-Zyklus: 2H+ pro 1e– 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

The FoF1-ATP synthase I at the end of the chain: producing ATP from the H+ gradient Capaldi, Aggeler, 2002 per turn: 10–14 H+  3 ATP 1 ATP ≙ 4 H+ 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

The electron carriers Cytochrome c: electrons from bc1 to RC • heme in a hydrophilic protein shell • 3.3 nm diameter Ubiquinon UQ10: carries electron–proton pairs from RC to bc1 • hydrophobic tail • long (2.4 nm) isoprenoid tail taken from Stryer 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Tubular membranes – photosynthetic vesicles where are the bc1 complexes and the ATPase? Jungas et al., 1999 100 nm Bahatyrova et al., 2004 no bc1 found! 200 nm LH1 RC bc1? * 50 nm 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Chromatophore vesicle: typical form in Rh. sphaeroides Lipid vesicles 30–60 nm diameter H+ and cyt c inside average chromatophore vesicle, 45 nm Ø: surface 6300 nm² Vesicles are really small! 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Photon capture rate of LHC’s relative absorption spectrum of LH1/RC and LH2 sun's spectrum at ground (total: 1 kW/m²) Wavelength [nm] dE/dλ [arb.] multiply Gerthsen, 1985 Cogdell etal, 2003 capture rate: 0.1 γ s kW Bchl + Bchl extinction coeff. normalization (Bchl = 2.3 Å2) Franke, Amesz, 1995 typical growth condition: 18 W/m² Feniouk et al, 2002 LH1: 16 * 3 Bchl  14 γ/s LH2: 10 * 3 Bchl  10 γ/s 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

LH1 / LH2 / RC — native electron micrograph and density map Area per: per vesicle (45 nm) LH1 monomer (hexagonal) 146 nm² LH1 dimer 234 nm² LH2 monomer 37 nm² LH12 + 6 LH2 456 nm² 11 Siebert etal, 2004 125 * 195 Ų, γ = 106° Chromatophore vesicle, 45 nm Ø: surface 6300 nm² 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Photon processing rate at the RC Which process limits the RCs turnover? Unbinding of the quinol  25 ms Milano et al. 2003 + binding, charge transfer ≈ 50 ms per quinol (estimate) with 2e- H+ pairs per quinol  40–50 γ/s per RC  22 QH2/s 1 RC can serve 1 LH1 + 3 LH2 = 44 γ/s LH12 + 6 LH2 ≙ 456 nm²  11 LH1 dimers including 22 RCs on one vesicle  480 Q/s can be loaded @ 18 W/m² per vesicle 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

The F1F0-ATP synthase  1 ATP ≙ 4 H+ "…mushroom like structures observed in AFM images…" Gräber et al, 1991, 1999 limited throughput of the ATPase "Arrhenius" "binding"  ATPase is "visible" 1 ATPase per vesicle Feniouk et al, 2002 ATPase from ATP/s H+/s chloroblasts <400 1600 E. coli <100 400 per turn: 10–14 H+ per 3 ATP  1 ATP ≙ 4 H+ 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

How much bc1? in out  1 dimer "pumps" 168 H+ / s x5 !!! measured enzymatic activity per bc1 dimer: 84 cyt c are reduced / s Xiao et al. 2000 in out  1 dimer can process 42 QH₂ / s  1 dimer "pumps" 168 H+ / s 400 H+ / s per ATPase x5 !!!  11 bc1 dimers per vesicle can be loaded by RCs  proton generation by 2.4 bc1 dimers per vesicle enough to drive 1 ATPase safety first! number of bc1 complexes should be limited by how many protons can be pumped out by ATPase 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

bc1 Placement — Diffusional limits? Roundtrip times maximal capacity of the carriers: T = TRC + Tbc1 + TDîff Cytochrome c₂: TRC ≈ 1 ms Tbc1 ≈ 12 ms TDiff ≈ 3 μs Tround-trip = 13 ms  ≤ 3 cyt c per vesicle sufficient to carry e-‘s available: 22 cyt c per vesicle Quinol: Diffusion is not limiting TRC ≈ 50 ms Tbc1 ≈ 23 ms TDiff ≈ 1 ms Tround-trip = 75 ms  ≤ 7 Q per vesicle sufficient to carry e-’s. T_{c_2} = 2\, \frac{(2R_i)^2}{6\, D_0} T_Q = 2\, \frac{(\pi\,R_m)^2}{4\, D_Q}  poses no constraints for the position of bc1 available: 100 Q per vesicle 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Proposed setup of a chromatophore vesicle At the „poles“ green/red: the ATPase light blue: the bc1 complexes Increased proton density close to the ATPase. favors close placing ATPase and bc1 complexes. yellow arrows: diffusion of the protons out of the vesicle via the ATPase and to the RCs and bc1s. blue: small LH2 rings (blue) blue/red: Z-shaped LH1/RC dimers form a linear array around the “equator” of the vesicle, determining the vesicle’s diameter by their intrinsic curvature. Geyer, Helms, Biophys. J. (2006) 91, 921 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

reconstituted LH1 dimers in planar lipid membranes Upper panel: drawn after the AFM images of Scheuring et al (4) of LH1 dimers reconstituted into planar lipid membranes. The Z-shaped dimers are seen from their cytoplasmic side. The average height of the membrane is indicated in the upper panel by the grey level of the background. Scheuring et al measured the distances between the minima of the AFM height scan to be 38.5 nm and the distance be tween the lowest and the highest parts to be 3.8 nm. Lower panel: interpretation how alternatingly oriented LH1 dimers may explain the observed height scan indicated by the dashed lines. These values are nicely reproduced by the proposed arrangement of the LH1 dimers, when one assumes that they are stiff enough to retain the bending angle of 26 that they would have on a spherical vesicle of 45 nm diameter and taking into account the length of a single LH1 dimer of about 19.5 nm. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Photosynthese: Lehrbuch-Darstellung 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Darstellung des photosynthetischen Apparats als Fließband Dicke Pfeile : Pfad, durch den die Photonenenergie in chemische Energie umgewandelt wird, die in ATP gespeichert wird. Abgerundete Rechtecke kennzeichnen Zwischenzustände. Jede Umwandlung findet in parallel arbeitenden Proteinen statt. Ihre Anzahl N mal der Konversionsrate eines einzelnen Proteins R bestimmt den gesamten Durchsatz dieses Schritts.  : eintreffende Photonen, die in den LHCs aufgefangen werden. E : Exzitonen in den LHCs und in den RCs e−H+ Elektronen–Protonen –Paare, die auf den Quinonen gespeichert werden. e− sind die Elektronen auf den Cytochrom c2 pH : Protonengradient über die Membran H+ : Protonen außerhalb des Vesikels 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Modellierung interner Prozesse am Reaktionszentrum Die Summe aller Einzelreaktionen mit ihren individuellen Raten k bestimmt die gesamte Umsatzrate RRC eines einzelnen RC. Dicke Pfeile : Energiefluss von den Exzitonen durch die kreisförmigen Änder-ungen der Ladungszustände des special pair Bchl (P) im RC. Abgerundete Rechtecke : Reservoirs. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Parameter 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Stochastische Dynamiksimulationen II Produktionsläufe fester Parametersatz Integriere Ratengleichungen mit: - Gillespie-Algorithmus (Assoziationen) - Timer-Algorithmus (Reaktionen); 1 Zufallszahl bestimmt, wann die Reaktion stattfindet. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Beispiel: Bindung und e- Transfer am Reaktionszentrum 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Stochastische Simulationen eines kompletten Vesikels Modellvesikel: 12 LH1/RC-Monomere 1-6 bc1 Komplexe 1 ATPase 120 Quinone 20 Cytochrom c2 Integrationszeitschritt: 10 s Eine Minute Realzeit zu simulieren benötigt 1,5 Minuten auf einem Opteron 2.4 GHz Prozessor. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Simuliere einen Anstieg der Lichtintensität Erhöhe Lichtintensität langsam während 1 Minute von 0 auf 10 W/m2 (Quasi-Gleichgewicht)  Es gibt zwei Regimes - eines wird durch das verfügbare Licht begrenzt - eines durch den Durchsatz der bc1 Geringe Lichtintensität: Linearer Anstieg der ATP-Produktion mit der Lichtintensität Hohe Lichtintensität: Sättigkeit wird desto später erreicht umso größer die Anzahl an bc1 Komplexen Geyer, Lauck, Helms, J. Biotech (im Druck) 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Oxidationszustand des Cytochrom c2 Pools geringe Lichtintensität: alle 20 Cytochrom c2 werden durch bc1 reduziert hohe Lichtintensität: RCs sind schneller als die bc1, die c2s warten auf Elektronen 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Oxidationszustand des Cytochrom c2 Pools mehr bc1 Komplexe können mehr Cytochrom c2 beladen. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Gesamtzahl an produziertem ATP Blaue Linie: Beleuchtung Geringe Lichtintensität: jede Unterbrechung stoppt ATP-Produktion Hohe Lichtintensität: Unterbrechungen bis 0.3 s Dauer werden abgepuffert. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

c2 Pool wirkt als Puffer Bei hoher Lichtintensität ist der c2 Pool vorwiegend oxidiert. Wenn das Licht abgedreht wird, arbeitet bc1 weiter (c2s beladen, Protonen pumpen, ATPase zur Produktion von ATP antreiben) bis der c2 Pool vollkommen reduziert ist. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge

Zusammenfassung Chromatophoren-Vesikel sind ein ideales Modellsystem um molekulare Simulationen und Differentialgleichungsmodelle zu verknüpfen. Obwohl einige Parameter immer noch nicht experimentell bekannt sind, kann mit dem bekannten Wissen ein detailliertes kinetisches und räumliches Modell erstellt werden. Mit solchen Systemen kann man testen, wieviel Wissen über ein System erforderlich ist um es komplett simulieren zu können. Vorhersagen müssen durch neue Experimente getestet werden! Solche Tests sind unbedingt nötig bevor man ein Modell als korrekt bezeichnen kann. 12. Vorlesung WS 2006/07 Softwarewerkzeuge