Timing, self-control and a sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability David Summers Department of Genetics, Downing Street, Cambridge, UK

Ausgangssituation Fragen: Bekannt ist: multicopy plasmide werden bei der Zellteilung zufällig auf die Tochterzellen übertragen natürliche Plasmide sind extrem stabil hinsichtlich ihrer Kopienzahl künstliche Vektoren (pUC-Reihe) gehen unter nicht-selektiven Bedingungen schnell verloren multicopy-plasmide können durch Rekombination leicht multimerisieren wie wird die Kopienzahl reguliert? wie werden Multimere aufgelöst?

Modelle zur Kontrolle der Kopienzahl Sufenmodell: hohe Replikationsrate bis zum Sollwert, dann kompletter Stop Exponentielle Kinetik: Mittelwert Hyperbolische Kinetik: umgekehrte Proportionalität zw.Kopienzahl und Replikationsrate

Replikationskontrolle des Plasmids ColE1 RNAII Präprimertranskript wird transkribiert hybridisiert am OriV Spaltung durch RNAse H Spaltprodukt bildet Replikationsprimer Replikation startet

Replikationskontrolle des Plasmids ColE1 RNAI-Repressortranskript interagiert mit RNAII Veränderte Faltung der RNA keine Primerbildung, keine Transkription

Folgen der Plasmid-Multimerisierung Bereits kleiner Anteil an Dimeren wirkt sich aus Chance, dass plasmidfreie Zellen entstehen Dimer hat doppelte Chance, repliziert zu werden Dimere verdrängen Monomere Dimer Katastrophe Aber: Zellen mit Multimeren wachsen langsamer

Auflösung von Plamid-Multimeren Replikationsstellen auf Plasmiden: cer-site aus 240 Bp Bindestelle für XerC- und XerD-Rekobinase Weitere Proteine: ArgR und PepA Rekombination an cer folgt topologischem Zwang XerCD könnte in cis und in trans rekombinieren Topologischer Zwang muss von anderen Proteinen stammen

ArgR bildet in Gegenwart von Arginin eine Hexamer enthält DNA-Bindedomäne bindet an ARG-Boxen (z.B. cer-site) biegt DNA um 70-90° Mutation von ArgR senkt Zwang zum cis-Produkt

Zustand im Plasmid-Monomer: ArgR, XerCD und PepA bilden Komplex an cer-site ArgR kann als „Dimer von Trimeren“ angesehen werden Ein Trimer kann die cer-site binden

Zustand im Plasmid-Dimer 2 single-site Komplexe assoziieren Synaptischer Komplex ArgR bildet Brücke

Zustand im Plasmid-Dimer Arg alleine ist zu schwach um den Komplex zu stabilisieren Stabilisierung durch Anlagerung von Supercoil-DNA Stabilisierung kann nur in cis funktionieren Topologisch einzigartiges Rekombinationsprodukt

Verbindung zwischen Rekombination und Zellteilung Promotor Pcer an der cer-site Genprodukt (Rcd) inhibiert Wachstum der Zellen Stopp des Zell-Zyklus c(Rcd) ist in Zellen mit Multimeren erhöht Synaptische Komplexe verändern DNA-Struktur und ermöglichen Transkription von Pcer Rcd bildet eine Checkpoint bei der Replikation

Der Rcd-Checkpoint Bei Zellteilung mit unvollständiger Multimerauflösung besteht die Gefahr plasmidloser Tochterzellen Problem: langsamer Rekombinationsmechanismus Erster Strangaustausch wird von XerC katalysiert Bildung der Holiday-junction Kein XerD-katalysierter Austausch den Gegenstrangs Komplex muss disoziieren, Auflösung der Holiday-junction erfolgt durch zelleigene Resolvase Verlangsamung des Gesamtvorgangs Erhöhung der Chance von Multimeren

Zusammenfassung Plasmid-Multimere stellen die Zelle vor Probleme Xer-cer Rekombination löst Multimere auf Langsamer Vorgang Rcd-Checkpoint sichert Replikation ab