10. Die instrumentelle Samenübertragung beim Pferd Vorlesung 7.Semester, WS 2007-08 Andrologie und Künstliche Besamung 10. Die instrumentelle Samenübertragung beim Pferd

Die instrumentelle Samenübertragung beim Pferd Allgemeines Pferdebesamungsstationen Zuchtwertschätzung der Hengste Tierseuchenrechtliche und zuchthygienische Anforderungen an Besamungshengste Sexualverhalten des Hengstes Samengewinnung Samenbeurteilung Samenaufbereitung- und konservierung Insemination

Allgemeines Das Pferd gehört zu den Species, bei denen die Samenübertragung schon sehr früh erfolgte Im 20. Jahrhundert gewann die KB an Bedeutung als eine Methode für die Praxis vor allem in der Sowjetunion, in Japan, in den USA und in China Allerdings setzte sie sich sehr langsam durch. Gründe dafür: Wirtschaftliche Bedeutung des Pferdes in der gesellschaftlichen Entwicklung unterschiedlich Fortpflanzungsphysiologische Besonderheiten des Pferdes waren nicht genau bekannt Haltung der Züchter oder Zuchtverbände: Zurückhaltung, Skepsis oder sogar Ablehnung

Die instrumentelle Samenübertragung wird in den USA nicht zugelassen von: ● Jockey Club for Thoroughbreed ● Standard Jack & Jennet Registry of America ● American Miniature Horse Association The objections to AI by the Thoroughbreed registration authorities ………….. ………………………………….objection is now eliminated by blood testing. Die Vollblutzucht-Behörde in Großbritanien haben wahrscheinlich deshalb Bedenken gegenüber der KB, weil diese es ermöglich, eine übergroße Zahl von Fohlen eines einzelnen Hengstes in die Welt zu setzen. Außerdem besteht theoretisch die Möglichkeit, das System zu missbrauchen und Fohlen als Nachkommen des falschen Hengstes auszuweisen. Letzteres kann heute durch Bluttests ausgeschlossen werden.

Allgemeines Entwicklung der Besamung in Deutschland Nach dem 2. Weltkrieg wurde sie genutzt, um die Deckseuchen zu bekämpfen. Heutzutage ist sie eine sehr wichtige biotechnische Methode in der Pferdezucht. Nachdem die sog. Frischsamenübertragung in den 80er Jahren in der Reitpferdezucht eingeführt wurde, ist die Anwendung der Besamung sprunghaft gestiegen

Entwicklung verschiedener Reproduktionstechniken in der Reitpferdezucht 1 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 1985 1990 1995 2000 2005 Frisch-Sp. Tiefgefrier-Sp. Natursprung Embryotransfer 573 40996 11399 37792 33586 846 28696 766 33162 14214 1038 36219 9366 915 309 1 FN, Jahresbericht 2004

Bedeutung der künstlichen Besamung beim Pferd aus zuchthygienischer Sicht Effiziente Nutzung des Samens von sehr gefragten Hengsten Vermeidung von Krankheiten, die durch den Deckakt übertragen werden können Vermeidung des Risikos von Verletzungen während der natürlichen Paarung Regelmäßige Spermakontrolle Hengste können während der Decksaison im Leistungssport bleiben Überbrückung von geographischen Entfernungen Bevorratung von Samen genetisch wertvoller Hengste Nutzung von subfertilen Stuten und Hengsten

Pferdebesamungsstationen Z.Z. mehr als 120 Stationen nach EU-Recht zugelassen Träger: Landgestüte, private Hengsthaltung Bereiche: Spermagewinnung, Spermaaufbereitung, Insemination Sprungraum - Grundfläche: > 6 x 6 m - Höhe > 4 m trittsicher kleiner separater Raum für Reinigung und Desinfektion von genutzten Materialien

Zuchtwertschätzung von Besamungshengsten es gibt kein Besamungszuchtprogramm Wandlung der Zuchtziele ▪ frühe Pferdehaltung für die Arbeit und fürs Militär ▪ heute hauptsächlich für den Sport (Leistung- und Freizeitsport Deutsche Reiterliche Vereinigung (FN, Fédération Equestre Nationale) : Dachorganisation für den Pferdesport, Pferdehaltung und Pferdezucht

2. Selektionsstufe: Hengstvorauswahl (2,5 Jahre), tierärtzliche Untersuchung, Körung

Nach EU-Richtlinien zu untersuchende Infektionen beim Hengst Ursprungsbestand Quarantäne Station Status Untersuchung auf Untersuchung auf Bestand ist • Infektiöse Anämie • Infektiöse Anämie amtlich frei von • Equine Arteritis • Equine Arteritis • Beschälseuche • Taylorella equi- • Taylorella equi- • Rotz genitalis genitalis • Pferdeencephalo- myelitis • Infektiöse Anämie • Stomatitis vesicularis • Tollwut • Milzbrand • Pferdepestfreie Region Bestand ist klinisch frei von: • Equiner Arteritis • Kontagiöser Equiner Metritis Stallion AI-Stud EC (92/65; 95/176

Genitalerkrankungen beim Hengst Spezifische Genitalinfektionen Beschälseuche (Dourine) CEM (Kontagiöse equine Endometritis) Bläschenauschlag (Koitalexanthem) Equine virale Arteritis (EVA) Unspezifische Genitalinfektionen durch: -hämolysierende Streptokokken Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae E. coli Salmonella abortus equi Pilze

Beschälseuche (Dourine) (Erreger: Trypanosoma equiperdum)

Bläschenausschlag (Koitalexanthem) (Erreger: EHV-3)

Sexualverhalten des Hengstes (I) In Anwesenheit einer rossigen Stute präkoitale Phase ▪ Nach Kontakt mit der Stute Emisio penis und Erektion des Penisschwellkörpers innerhalb von 1-3 min. ▪ Flehmen ▪ Beriechen von Harn- und Kot- ansammlungen

Sexualverhalten des Hengstes (I) In Anwesenheit einer rossigen Stute präkoitale Phase ▪ scharrende, auch schlagende Bewegung der Vorderhand ▪ Hindrängen zur Stute

Sexualverhalten des Hengstes (II) ● Koitale Phase ▪ Aufsprung ▪ Umklammerung der Stute mit der Vorderhand ▪ Suchbewegungen ▪ Einführen des Gliedes ▪ Friktionsbewegungen: 6-8 Beckenschüben ▪ Ejakulation: Dauer etwa 20 – 30 sec. ● Postkoitale Phase

Ablauf der Paarungsreflexkette beim Hengst Vorspiel Versteifung des Gliedes mit extrapräputialer Verlagerung Aufsprung auf den Deckpartner mit Umklammerung Suchbewegungen Einführung des Gliedes in die Scheide Friktionsbewegungen Ejakulation (mehrphasisch) Absteigen mit Erschlaffung und Einschachten des Gliedes

Samengewinnung(I) Sprungpartner: gut rossige Stute (möglichst keine Maidenstute) Pferdeattrappe (Phantom)

Samengewinnung(II) Methode der Wahl: Anwendung der künstlichen Vagina ● Hannover-Modell ● Missouri-Modell ● Colorado-Modell ● Krakower-Modell Alternativmethoden: - Nutzung eines Kondoms - manuelle Massage der Glans penis - Pharmaka-Anwendung (Xylazin, Imipramin, PGF2ἇ

Modell Hannover Modell Colorado

Missouri Vagina

Modell Krakow

Ejakulation beim Hengst Fraktion Konsistenz Zusammensetzung 1. Fraktion wässrig spermafrei (fast!) Bulbourethraldrüsensekret 2. Fraktion milchig Nebenhodensperma Samenleiterampullensekret 3. Fraktion gallertartig Samenblasendrüsensekret

Spermawerte beim Hengst und Mindestanforderungen für den Einsatz in der KB Parameter Schwankungsbreite Mindestanford. Volumen 20 –120 ml 40 ml Farbe milchweiß bis bläulich-grau Konsistenz molke- bis milchähnlich pH-Wert 6,5 – 7,3 Spermienkonzentration 80 – 330 x 106/ml 100 x 106/ml Gesamtspermienzahl 5 –12 x 109 6 x 109 Gesamtmotilität 60 – 90 % 70 Vorwärtsmotilität 30 – 60% 50 % Anteil lebender Spermien 70 –90 % 80 % morphol. intakte Spermien 60 – 80 % 70 %

Ejakulatmerkmale bei Miniaturhengsten (<86,5 cm) und Ponys (<96,5 cm)1 1Nach Paccamonti et al. (1999)

Spermaaufbereitungsformen Nativsperma (Frischsperma) flüssigkonserviertes Sperma tiefgefrierkonserviertes Sperma

 Insemination 15 – 20 min. nach Nativsperma ● Hengstspermien sind in unverdünntem Zustand kurze Zeit befruchtungsfähig  Insemination 15 – 20 min. nach Spermagewinnung durchführen ● Besamungsportion: 1 – 5 ml (abhängig von der Spermienkonzentration) ● Besamungsdosis: 250 Mio. vorwärtsbewegliche Spermien ● > 80% Trächtigkeitsrate

Flüssigkonservierung Die Konservierungsfähigkeit des Hengstspermas in flüssigem Zustand ist begrenzt. Die meisten Verdünner enthalten Milch bzw. Milch- produkte oder Eidotter als Zusätze. Für eine kurzfristige Spermakonservierung (bis zu 12 Std.) wird das Verdünnen in ein Verhältnis von 3:1 vorgenommen. Die Besamungsdosis ist bei > 300 x 10 vorwärtsbeweglich Spermien einzustellen; die Besamungsportion sollte 10-20 ml betragen. Für eine längerfristige Spermakonservierung ( bis zu 24- 36 Std.) wird das verdünnte Sperma zentrifugiert, resuspendiert und erneut verdünnt. Die Besamungsdosis liegt bei 600 x 10 vorwärtsbewegliche Spermien; die Besamungsportion beträgt 5-15 ml.

Spermaverdünner Magermilch-Verdünner (nach Kenney) Trockenmagermilch 2,4 g Glucose 4,9 g Aqua bidest. 92,0 ml Na-bicarbonat 1,6 ml Gentamycin-Sulfat 100 mg  Konservierungsdauer: 12-24 Stunden Glycin-Eidotter-Verdünner Verdünner mit Sojabohnenlecithin Kenney-Magermilch-Verdünner Verdünner mit Sojabohnenlecithin

Aufbewahrung des Flüssigspermas Frischsperma ▪ +18 - +20°C ▪ aerob Versandsperma ▪ + 5°C ▪ anaerob

Versandbehälter

Tiefgefrierkonservierung sie wird vorwiegend für den Samenexport genutzt, aber auch für den Samen von Hengsten, die nicht dauern in der Zucht eingesetzt werden, oder für die Bevorratung von Spermareserven Die Spermaaufbereitung erfolgt fast genauso wie für die des Versandspermas. Die Besamungsportion wird in 0,5 Pailletten hergestellt. Die Abkühlung und Tiefgefrieren erfolgt in Stickstoffdampf und die Lagerung in Containern mit flüssigen Stickstoff. Eine Besamungsportion enthält 800 x 10 vorwärtsbewegliche Spermien. Mittlere Pailletten (0,5 ml)

Insemination Schwerpunkt ist die Prüfung der Rosse: Nutzung des Abprobierhengstes Rektale Untersuchung: Ovaraktivität, Nutzung der Sonographie

vor allem für die TG-Sperma-Nutzung geeignet Insemination Zeitpunkt der Insemination: ▪ nach Brunstverhalten: Sie erfolgt ab dem 3. Tag der Rosse jeden 2. Tag (o. auch alle 36 Std.), bis die Stute den Probierhengst für Anwendung des Frischspermas vertretbar ▪ nach Follikelkontrolle: Sie erfolgt, wenn der Graafsche Follikel weich ist, oder post ovulationem (Stute wird also alle 6 Std. rektal untersucht) vor allem für die TG-Sperma-Nutzung geeignet

Insemination Beste Inseminationsergebnisse: ( bei einmaliger Besamung) Frischsperma: 36 Stunden a. ov. bis 8 Stunden p.ov. Versandsperma: 24 Stunden a. ov. bis 8 Stunden p. ov. TG-Sperma: 12 Stunden a. ov. bis 8 Stunden p. ov.

Vorkehrungen vor der Insemination Die Stute wird in den Inseminationsstand geführt oder die Hinterbeine werden ausgespannt. Bei Stuten mit Fohlen bei Fuß soll das Fohlen am Kopf der Stute gehalten werden oder in Box unmittelbar neben der Stute.

Inseminationstechniken Ort der Samendeponierung MARE

Ort der Sameneinführung ● Unter Sichtkontrolle

Sameneinführung unter manueller Führung der Inseminationspipette Einführung der Pipette in die Vagina Passage durch den Zervikalkanal

Ort der Sameneinführung tief intrakornuale Samendeponierung ▪ Nutzung von verlängerten flexiblen Besamunsinstrumenten ▪ Unter transrektaler manueller Kontrolle ▪ Ort der Deponierung: - im Bereich der Uterusspitze - endoskopisch an der uterotubalen Verbindung ▪ Ziel der neuen Technik: Reduzierung der Spermienzahl (« low-dose-insemination ») ▪ Schwellenwert bei 5 x 10 vorwärtsbewegliche Spermien

Auftauen des Tiefgefrierspermas beim Pferd Pailletten 37° C 30 sec. Makrotüb 50° C 40 sec.

11. Die instrumentelle Samenübertragung beim Schaf und bei der Ziege

Künstliche Besamung beim Schaf und bei der Ziege Allgemeines Die KB beim Schaf gilt als eine der ältesten Methoden der Biotechnik der Fortpflanzung. Anfang des 20. Jahrhunderts starke Verbreitung der KB in der Praxis in der damalige SU (1936: mehr als 6,5 Mio. Schafe wurden besamt). Die tatsächliche Ausdehnung der ovinen KB in der Welt ist unbekannt. Sie wird in manchen Ländern im Rahmen von Zuchtprogrammen und Leistungsprüfungen angewendet. Die kaprine KB entwickelte sich später als beim Schaf. In Deutschland wurde in den 40er Jahren damit begonnen. Ende der 50er Jahre wurden in Leipzig bis 30.000 Ziegen besamt! Die KB bei der Ziege hat in einigen Ländern einen hohen Stellenwert: Japan, Frankreich, in der Schweiz, in den USA. In der deutschen Schafzucht ist die KB kaum von Bedeutung, höchstens bei den Milchschafen.

Künstliche Besamung in der deutschen Ziegenzucht In den letzen 10 – 12 Jahren wurde ihre Nutzung insbesondere in den neuen Bundesländern angestrebt. Zweck: Aufbau eines Systems der Nachkommenschaftsprüfung wertvoller Vatertiere Leistungserhöhung vor allem in der Milchleistung und im Milchfettgehalt

Tierart ► Schafbock Ziegenbock Mindest- Parameter ▼ anforderungen Volumen (ml) 1,0 (0,3 – 3,0) 1,5 (0,5 – 3,0) 0,5 Farbe, elfenbein-gelblich elfenbein-gelblich Konsistenz milchig-rahmig milchig-rahmig Konzentration 3,0 (1,5 – 5,0) 3,0 (2,5 – 5,0) 1,5 (x 109/ml) Massenbewegung + - +++ + - +++ ++ (Skala: + - +++) Vorwärtsbewegliche 70 (50 – 85) 75 (40 – 80) >60 Spermien (%) Abnorme Spermien (%) max. 20 Spermawerte beim Schaf- und Ziegenbock und Mindestanforderungen für den Einsatz in der Besamung

Flüssigkonservierung des Spermas beim Schafbock Verdünner Konservierungs- Einsatzdauer temperatur (°C) (Std.) Eidotter-Glucose-Citrat 2 - 5 bis 24 Eidotter-Citrat Eidotter-TRIS-Fructose Pasteurisierte Milch 18 - 22 bis 8 Trockenmagermilch

Spermaverarbeitung (Schönower Verfahren) KB-Ziege Spermaverarbeitung (Schönower Verfahren) Zentrifugieren des Gesamtejakulates + Verdünner1 Resuspendieren des Dekantats mit Verdünner Ermittlung der Paillettenzahl Äquilibrierung des verdünnten Ejakulates Füllen der Pailletten (0,25 ml Fassungsvermögen) Einfrieren der Pailletten (LN2-Dampf) Tiefgefrieren der Pailletten (LN2) 1Triladyl (Na-Citrat, TRIS, Fructose, Glycerol, Antibiotika)

Durchführung der intrazervikalen Insemination (schematisch) Zeichnung: J. Breitmeier

ewe

Konzeptionsergebnisse nach Insemination von Merinoschafen in Abhängigkeit vom dabei beobachteten vaginal-zervikalem Schleimtyp1 1Nach Entwistle und Martin (1972)

Insemination beim Schaf (flüssigkonserviertes Sperma) Besamungsportion Volumen: 0,25 ml Dosis: 80 Mio.vorwärtsbewegliche Spermien Besamungszeitpunkt 12 – 14 Stunden nach Feststellung der Brunst (mit Bock)

Brunstsynchronisation   Nutzung von Vaginalspangen (EAZI-Breed CIDR, Inter Ag Hamilton, Neuseeland), Wirkstoff 0,33 g Progesteron und/ oder Vaginalschwämmchen (Chronogest, Internet International B.V. Boxmeer Holland), Wirkstoff 40 mg FGA Entfernung der Vaginalspangen bzw. -schwämmchen nach14 Tagen und Applikation von 300 I.E. PMSG (Pregmagon "Dessau", Dessau-Tornau) i.m.

Insemination Methode: Deponieren des Spermas intrazervikal oder intrauterin Zeitpunkt: KB1 45-48 Stunden nach der PMSG-Applikation KB2 24 Stunden nach der KB1  Auftautemperatur der Besamungsdosis: 70°C für 5 sec.   Besamungsinstrumente: Spreizspekulum mit Lichtquelle Besamungsgerät f. Kleinwiederkäuer

Insemination bei der Milchziege (TG-Sperma) Besamungsportion Volumen: 0,25 ml Dosis: 100-200 Mio. vorwärtsbewegliche Spermien Besamungszeitpunkt 15 – 24 Stunden nach Feststellung der Brunst (mit Bock)

Samenübertragung bei der Ziege Parameter:   Zahl der Stunden nach Brunstbeginn Intensität der Brunst - keine Brunst + schwache Brunst ++ mittelstarke Brunst +++ starke Brunst Beschaffenheit des Brunstschleimes S0 kein Schleim S1 glasklarer Schleim S2 rauchig-getrübter Schleim S3 käsig-rahmiger Schleim Öffnung der Cervix C0 Cervix geschlossen C1 Cervix für Besamungspistole passierbar C2 Cervix weit offen Gute Besamungsergebnisse sind zu erwarten, wenn folgende Parameterkombination vorliegt: 22 Std. / +++ / S2 / C1  Aus Bay,F.:KB bei Ziegen, 1997, Stuttgart