Lehrerfortbildung Juli 2011 Schülerversuch Geninduktion am Beispiel des lac-Operons von E.coli Prof. Dr. Andreas Beyer cand. stud. Yvonne Floer cand. stud. Karina van den Broek Ein Schul-tauglicher Versuch zur Untersuchung genetischer Regulation bei Bakterien: – Induktion und Repression –

Das lac-Operon CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term lacZ,Y,A-mRNA Grundsätzlicher Aufbau & Funktion des Lac-Operons: Promotorregion vor Transkript-kodierender Region: 3 orfs: lacZ (ßGalactosidase: Hydrolyse von Laktose) lacY (Laktose-Permease: passiver Laktose-Transporter imMembran) lacA (Transacetylase: Entgiftung von „falschen“ ßGal-Substraten?) Gal + lac- Permease ßGal trans -Ac Lac tose Glc

E.coli - Chromosom CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term Transkription lacZ,Y,A- mRNA Cytoplasma Translation Gal ßGal + Lac tose trans -Ac Glc Lac tose Lactose- Permease Zellmembran Medium Lac tose

Das lac-Operon: Der Repressor RNA -Pol Promotor lacI Term lacI-mRNA LacR RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term Funktion des Lac-Repressors, kodiert von lacI (oben): schwach, aber konstitutiv exprimiert. LacR bindet an Operator und blockiert die RNA-Pol: Operon ist still gelegt. trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA

Promotor lacI Term E.coli – Chromosom Transkription lacI-mRNA -Pol Promotor lacI Term E.coli – Chromosom Transkription lacI-mRNA Translation LacR RNA -Pol LacR LacR CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term lacZ,Y,A-mRNA lac- Permease ßGal trans -Ac

Das lac-Operon: Der Repressor RNA -Pol Promotor lacI Term lacI-mRNA Lac tose LacR RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term Falls Laktose vorliegt, bindet sie hochaffin an LacR  ΔKonf  kann nicht menr an Operator binden  lac-Operon frei gegeben. Anm: Die Bindung von Laktose erfolgt allosterisch, also nicht an der DNA-Bindestelle Anm: Die Bindung von Laktose erfolgt allosterisch, also nicht an der DNA-Bindestelle (wie es das Bild der Einfachheit halber suggeriert) trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA

X Promotor lacI Term E.coli – Chromosom Transkription lacI-mRNA -Pol Promotor lacI Term E.coli – Chromosom Transkription lacI-mRNA Translation Lac tose LacR Lac tose X RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term Anm: Die Bindung von Laktose erfolgt allosterisch, also nicht an der DNA-Bindestelle (wie es das Bild der Einfachheit halber suggeriert) lacZ,Y,A-mRNA Trans lation lac- Permease ßGal trans -Ac

Das lac-Operon: Glc-Repression RNA -Pol Promotor cAMP-RP Term cAMP CRP-mRNA CRP RNA -Pol RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term Katabolit-Repression: Die basale (= durch Laktose-Anwesenheit entblockte) Aktivität des Lac-Promotors ist sehr niedrig. cAMP ist in den meisten Bakterien ein internes Signal (second Messenger) für das Fehlen des „Lieblingssubstrats“ (in E.coli und vielen anderen: Glucose). In E.coli wird der cAMP-Spiegel über den Phosphoryleringsgrad des Glucose-Transporters in der Membran reguliert. Glucosemangel  Transporter nicht phosphoryliert  Adenylat-Cyclase aktiviert  cAMP-Synthese  cAMP wird von CRP gebunden. cAMP-CRP ist ein aktiver Transcriptionsfaktor, der viele Operons aktiviert, so auch das lac-Operon. Sofern es „entblockt“ ist (weil lacR nicht bindefähig, weil Laktose vorhanden), wird die basale Aktivität der Promotors um 2-3 Größenordnungen gesteigert . cAMP-Rezeptor-Protein (CRP) = catabolite gene activator protein (CAP) trans -Ac lac- Permease ßGal lacZ,Y,A-mRNA LacR Lac tose

X + + Promotor cAMP-RP Term CRP-mRNA Translation CRP CRP CAPbs Anm: cAMP-Rezeptor-Protein (CRP) = catabolite gene activator protein (CAP) RNA -Pol Promotor cAMP-RP Term cAMP CRP-mRNA Translation CRP cAMP CRP RNA -Pol RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term lacZ,Y,A-mRNA + + X Trans lation LacR lac- Permease ßGal trans -Ac Lac tose

Regulation des lac-Operons negatives Regulations-Element im Promotor: lacR bindet an Operator  blockiert Transkription in Abwesenheit vom Laktose Induktor Laktose bindet an lacR  LacR kann nicht mehr binden, Transkription ist entblockt positives Regulations Element im Promotor: aAMP-CRP komplex bindet an CRP-Bindestelle  Transcriptionslevel wird erheblich gesteigert (Mechanismus der Katabolit-Repression)

Regulation des lac-Operons CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term LacR X X ++ CRP ++ „Schaltbild“ der Regulation des lac-Operons cAMP Lac tose Transkription des lac-Operons

Das Versuchsprinzip lacZ  ß-Gaslactosidase als Reporter: Quantifizierung des Aktivitätsstatus‘ des lac-Operons über Aktivitätsmessung der ß-Gal. via Chromogen: proportionale Umsetzung von oNPG durch das Enzym Quelle: chemgapedia

Vorversuch: Wachstumskinetik Extinktion Zeit t in Minuten

Vorversuch: Wachstumskinetik  Glycerin verworfen

Setup des Versuchs E.coli H3000: intaktes lac-Operon Sicherheitsstamm (keine S-Stufe!) frische Übernacht-Kultur Standard-Medium LB 1:5 Verdünnung mit div. C-Quellen (Kinetik über 1h): nur LB Glucose Laktose Glucose + Laktose Zentrifugation, Zellaufschluss Zugabe von oNPG  definierte Zeit  Stopp optische Auswertung (semiquantitativ) Analyse: Korrelation mit den C-Quellen

Zellaufschluss (Lysozym) Setup des Versuchs 1:5 Verdünnung bei t=0 E.coli H3000: frische Übernacht-Kultur (Standard-Medium LB) nur LB …+Glc …+Lact …+Glc +Lakt Probennahme alle 20min Farb-test Zellaufschluss (Lysozym)

Ergebnis

semiquantitative Auswertung (Semi-)Quantifizierung mit Photoshop