Analytische Ultrazentrifugation (AUZ) Methodenseminar, Januar 2007 Analytische Ultrazentrifugation (AUZ) Alexandra Beusch, Beatrice Lafargue

Gliederung Aufbau der Analytischen Ultrazentrifuge Sedimentationslauf (Sedimentationsgeschwindigkeitslauf) Gleichgewichtslauf (Sedimentationsgleichgewichtslauf)

Fragestellung Homogenität der Probe (Sedimentationslauf) Sedimentationskoeffizient (Sedimentationslauf) Molekulargewicht (Gleichgewichtslauf)

Analytische Ultrazentrifuge (AUZ) max. 50 000 rpm Probe: 450 µl AUZ: 160 000€; Rotor: 18 000€; Zelle ca. 2 500€

Optische Systeme Probenkonzentration /-verteilung kann während des Laufes verfolgt werden Absorptionsoptik + Wellenlänge frei wählbar (190-800 nm) Probe muss Chromophor sein OD()= 0.5-1.5 Interferenzoptik Laser 675 nm + Probe muss kein Chromophor sein Unterschiedliche Brechungsindizes (Probe und Lösungsmittel) Geringere Empfindlichkeit -> höhere Proteinkonzentration (mind. 1mg/ml) + Schlierenoptik

Analytische Ultrazentrifuge (AUZ) Aufhängung Rotor Schlitten Absorption Linsensystem Interferenz Aufhängung Optik Radiometer

Strahlengang

Wirkende Kräfte Experiment Auswertung Van Holde Weischet Analyse Sedimentation Wirkende Kräfte Experiment Auswertung Van Holde Weischet Analyse

Wie setzt sich der Sedimentationskoeffizient zusammen?

Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fz ist dem Schwerefeld proportional Fz nimmt im Verlauf der Sedimentation zu mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel zu Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit

Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fb = Auftriebskraft Fb wirkt Fz entgegen abhängig von Lösungsmittel mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittels Vp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens

Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fb = Auftriebskraft Ff = Reibungskraft Ff wirkt Fz entgegen f ist abhängig von Form, Größe und Hydratation des Partikels Zwischen den drei Kräften stellt sich ein Gleichgewicht ein (< 1 ms) mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittels Vp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizient k = Boltzmann Konstante T = Temperatur D = Diffusionskoeffizient

Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fb = Auftriebskraft Ff = Reibungskraft mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittels Vp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizient k = Boltzmann Konstante T = Temperatur D = Diffusionskoeffizient

Sedimentationskoeffizient Wirkende Kräfte Wirkende Kräfte: Fz = Zentrifugalkraft Fb = Auftriebskraft Ff = Reibungskraft Einheit: = 1 S [Svedberg] mp = Partikelmasse r = radialer Abstand Partikel/Rotationsachse ω = Winkelgeschwindigkeit mLm = Masse des verdrängten Lsg.mittels Vp = Teilchenvolumen ρLm = Lösemitteldichte = partielles spezif. Volumen des Teilchens v = Geschwindigkeit des Teilchens f = Reibungskoeffizient k = Boltzmann Konstante T = Temperatur D = Diffusionskoeffizient

Welche Informationen liefert das Sedimentationsexperiment ?

Sedimentationsexperiment mögliche Erkenntnisse Bestimmung des/der Sedimentationskoeffizienten s Aussage über Zusammensetzung bzw. Reinheit der Probe (homogen, heterogen) Aussage über die partielle Konzentration der einzelnen Komponenten

Sedimentationsexperiment Vorab: Überlegungen In welchem Puffer soll Protein/Partikel gelöst sein ? z.B.: TRIS absorbiert bei 205 nm sehr stark, Phosphatpuffer nicht Bei welchen Wellenlängen möchte ich messen ? z.B.: 280 nm → aromatische AS, 205 nm → Peptidrückgrad Bei welcher Geschwindigkeit soll gemessen werden ? abhängig von MW; so hoch wie möglich, um die Diffusion an der Sedimentationsfront zu minimieren, ABER: es werden für eine gute Auswertung mind. 15-20 Scans für benötigt; im Zweifel mehrere Läufe bei unterschiedl. Geschwindigkeiten Wie viele Scans in welchem zeitlichen Abstand? so viele Scans wie möglich über die komplette Probenzelle in kurzem zeitlichen Abstand

Sedimentationsexperiment Vorbereitungen Reference = Lösungsmittel, 420 µl Sample = Probe in Lösungsmittel, 400 µl - unterschiedliche Befüllung wichtig für Messung der Menisken - sektorförmige Messzelle vermeidet Konvektionen Doppelsektorzelle Zelle zusammenbauen, befüllen und in Rotor einsetzen Rotor in Zentrifuge einsetzen, Optik einschrauben Zentrifuge starten und Vakuum ziehen lassen mind. 30 min bei geringer Geschwindigkeit (ca. 3000 rpm) einlaufen lassen, um konstante Temperatur zu erreichen Experiment starten Dauer: ca. 3 – 4 h

Sedimentationslauf Rohdaten Probe Lösemittel radiale Verdünnung durch sektorförmige Messzelle rm = Radius Meniskus rbnd= boundary (Wendestelle der Sedimentationsfront) rb = Radius Boden

Auswertung Programm: Ultrascan Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) Editieren des Rohdatensatzes (Anzeige der Menisken und des Plateaus)

Auswertung Programm: Ultrascan Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) Editieren des Rohdatensatzes (Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte („boundary“) auszuschließen)

Auswertung Programm: Ultrascan Auswertungssoftware: Ultrascan (by Borries Demeler and The University of Texas) Editieren des Rohdatensatzes (Anzeige der Menisken und des Plateaus; Möglichkeit, einzelne Scans zu eliminieren, um Randeffekte („boundary“) auszuschließen) Auswertung der bearbeiten Daten mit der Enhanced Van Holde-Weischet Analyse (vHWA)

Noch mal ein bisschen Theorie: Die Van Holde Weischet Analyse (vHWA) Auswertung vHWA Noch mal ein bisschen Theorie: Die Van Holde Weischet Analyse (vHWA)

Warum van Holde Weischet? Auswertung Warum vHWA? Warum van Holde Weischet? korrigiert für Diffusionseffekte Möglichkeit der besseren Auswertung von heterogenen Proben und Proben mit zwei oder mehr gut voneinander getrennten Komponenten Auswertung von Datenpunkten in Zell-Bodennähe und von Scans ohne stabiles Plateau möglich

Auswertung vHWA Verbreiterung der Sedimentationsfront (Boundary Spreading) : Diffusion vs. Heterogentiät Partikel unterliegt im Zentrifugalfeld ungerichteter und gerichteter Diffusion Ungerichtet: BROWNsche Molekularbewegung Gerichtet/wechselseitig: Konzentrationsgefälle an der Sedimentationsfront führt zu einer Verbreiterung der Sedimentationsfront = Vortäuschung breiter S-Verteilung; allerdings überwiegt mit vorschreitender Zeit die Sedimentation die Diffusion

Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Probe mit nur einer einzigen sedimentierenden Komponente

Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Probe mit mehreren Komponenten

Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität Auswertung vHWA Boundary Spreading: Diffusion vs. Heterogenität

Berechnung der apperenten Sedimentationskoeffizienten Auswertung vHWA Berechnung der apperenten Sedimentationskoeffizienten

Auswertung vHWA Extrapolationsplot

Auswertung vHWA Distributionsplot

Auswertung vHWA: Originaldaten

am Beispiel eines Einkomponentensystems Gleichgewichtslauf am Beispiel eines Einkomponentensystems

Gleichgewichtslauf 3x identische Probe Lösungsmittelmeniskus 100µl Probenmeniskus 3x identischer Puffer 120 µl Konzentrationsreihe

Gleichgewichtslauf Im Gleichgewicht kein netto-Stofftransport Diffusion Sedimentation 0 h 6 000 rpm 8 000 rpm 10 000 rpm Im Gleichgewicht kein netto-Stofftransport

Gleichgewicht ist abhängig von… Diffusion Sedimentation Molekulargewicht Pufferviskosität Länge der Flüssigkeitssäule Temperatur Winkelgeschwindigkeit Meniskus: darf kein Protein enthalten, Aber auch keine vollständige Sedimentation!

Gleichgewichtslauf MP =Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = Lösemitteldichte T = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachse c = Konzentration

Gleichgewichtslauf- lineare Auswertung Ergebnis: 147 - 377 kDa MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = Lösemitteldichte T = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachse c = Konzentration

Gleichgewichtslauf- Global Fit = Parameter können „freigegeben“ werden MP = Molekulargewicht Protein = partielles spezif. Volumen des Teilchens R = allg. Gaskonstante = [8.31 J/(K*mol)] ρLM = Lösemitteldichte T = Temperatur ω = Winkelgeschwindigkeit r = Abstand Partikel-Rotationsachse c(r) = Konzentration am Punkt r A = Amplitude B = Baseline

Gleichgewichtslauf- Global Fit

Gleichgewichtslauf- Global Fit

Zusammenfassung Gleichgewichtslauf: stationärer Zustand => Molekulargewicht mit hoher Genauigkeit Sedimentationslauf: Informationen über Sedimentationskoeffizient, Reinheit und Zusammensetzung der Probe

Vorteile Hydrodynamische Methode: Proteine in Lösung; kein Kontakt mit Trägermaterialien Gemische können analysiert werden Kein/kaum Probenverlust Absolutmethode: keine Kalibrierung Masse Größe Dichte

Literatur Software www.beckmancoulter.com www.nanolytics.de http://www.ultrascan.uthscsa.edu/