תרביות תאים מצמחים נושא 6 שקופיות 1 - 14 הבדלים בין תא צמח לתא בע"ח 1 הוא תא אאוקריוטי חסר דופן המהווה חלק מרקמה אנימאלית תא צמח הוא תא אאוקריוטי בעל דופן המהווה חלק מרקמה צמחית רשת אנדופלסמית גרעין מיטוכונדריה ריבוזומים ציטופלסמה קרום התא כלורופלסט מנגנון גולג'י וקואלה מרכזית דופן התא http://www.coe.uh.edu/archive/science/science_graphics/sciencegr10.html 1 כיתוב בירוק מאפיין תא צמח בלבד
השוואה בין תרבית צמחית ותרבית תאים מבע"ח תא בע"ח תא צמח תא גדול ( 10 מיקרון ) המהווה חלק מרקמה . תא חסר דופן. קרום התא חשוף תא רגיש יותר ללחץ מכני חיצוני הדנ"א נמצא בתוך גרעין (תא אאוקריוטי) זמן דור בתרבית ארוך 36-48 שעות (ימים ) דורש מצע גידול תומך מורכב יותר ( דרישות חמורות יותר ) ויקר יותר . דורש איוורור (חמצן )- התאים אירוביים דורש בקרת: PH , טמפ' והגנה מפני זיהום הרוב דורש משטח לתאחיזה בתרבית ויוצר רובד תאים חד-שכבתי (מיעוט גדל בתרחיף כמו תאי הדם) מוצרים המופקים מתרבית תאים של בע"ח יקרים תא גדול יותר ( 100 מיקרון ) המהווה חלק מרקמה. תא בעל דופן עשויה תאית המקיפה את הקרום תא רגיש ללחץ מכני חיצוני הדנ"א נמצא בתוך גרעין ( תא אאוקריוטי ) זמן דור בתרבית 20 – 40 שעות ( ימים ). דורש מצע גידול תומך מורכב מעט ( דרישות בינוניות ) ובמחיר בינוני . דורש איוורור (חמצן ) – התאים אירוביים דורש בקרת: PH , טמפ' והגנה מפני זיהום גדלים בתרבית במצע מוצק או בתרחיף המוצרים המופקים מצמחים מחירם בינוני 2
העשרה 3 רשימת אתרים להרחבה מבנה תא צמחי ותפקידי חלקיו מבנה תא צמחי ותפקידי חלקיו http://www.cellsalive.com/cells/plntcell.htm השוואה בין תא צמח לתא בע"ח http://waynesword.palomar.edu/lmexer1a.htm http://www.coe.uh.edu/archive/science/science_graphics/sciencegr10.html השוואה בין תא צמח לתא חיידק http://www.fao.org/docrep/t0831e/t0831e02.htm 3
סוגי תרביות צמחיות והמעבר ביניהן הכנת תרביות צמחיות חשיבות הכנת תרביות מצמחים : הצמחים מהווים מקור חיוני לחומרי מזון ולחומרי רפואה לאדם. בעבר : הפיקו את החומרים האלה מצמחים ע"י הכנת מיצוי צמחים . בהווה : ההפקה ע"י גידול תרביות תאי צמח . היתרונות: 1. תרביות צמחיות מהוות תחליף יציב יותר להפקה בתנאי מעבדה מוגדרים וקבועים . 2. ניתן לכוון ולשפר את יצירת התוצר בתאים מבחינה איכותית וכמותית (ייצור-יתר) . 3. ניתן לבצע שינוי בתכונות התוצר ע"י החדרת תכונות רצויות לתאים. 4. ניתן לקצר את משך בזמן הדרוש לקבלת התוצר ללא תלות בתהליך המתרחש בטבע. סוגי תרביות צמחיות והמעבר ביניהן 1 2 3 תרבית רקמה (קלוס callus) תרבית תרחיף תאים Suspension ) ) תרבית תרחיף פרוטופלסטים מעבר מעבר אפשרי 4 http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29a.htm
הכנת תרבית רקמת קלוס ( callus) מרקמה צמחית 1 מוציאים קטעי רקמה צמחית קטנים מחלקי צמח שונים : עלה,שורש,גבעול רקמת צמח בוגר מבצעים חיטוי של מקטע הרקמה ע"י טבילה בחומר מחטא מניחים על מצע אגר מוצק הנמצא בכלי גידול שקוף המאפשר חדירת אור ואויר במנדף סטרילי מדגירים באינקובטור או בחדרי גידול עם תאורה בתנאי מעבדה מוגדרים ומבוקרים נוצר גוש תאי קלוס . זהו גוש של תאים לא ממוינים המתחלקים ומתרבים על מצע האגר המוצק . חיתוך גוש הקלוס לקוביות קטנות יותר והעברות חוזרות במצע אגר טרי מתקבלת תרבית קלוס אחידה על מצע מוצק תרבית קלוס : מסה של תאים לא ממוינים , בעלי כושר ריבוי , שמקורם ברקמת איחוי צמחית , הנמצאת בכל חלקי הצמח הבוגר . 5 http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/callus.gif http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29a.htm
הכנת תרחיף תאים צמחיים ( suspension) מקלוס 2 רקמת קלוס מתרבית מעבירים חתיכה של קלוס למצע נוזלי המכיל מזון והורמונים לגידול מטלטלים טלטול מתמיד על מתקן מיוחד לצורך ערבול והפרדת הגוש לתאים בודדים גוש הקלוס נפרד לתאים בודדים המתרבים במצע הנוזלי ונוצר תרחיף תאים לא ממוינים מטלטל תרבית http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/callus.gif מתקבלת תרבית תאים בודדים או בצברים המתחלקים (ללא התמיינות ) בתרחיף 6
הכנת תרבית פרוטופלסטים מפרוטופלסטים בתרבית ניתן לקבל תרבית קלוס 3 תאים סומאטיים של צמח בוגר תאי צמח בוגר מסירים את דופן התאים העשויה צלולוז (תאית ) בעזרת האנזים צלולאז הסרת דופן התאים מתקבלים פרוטופלסטים ( תאים צמחיים חסרי דופן ) במצע נוזלי, ונוצר תרחיף פרוטופלסטים הפרוטופלסטים מתחלקים ומתרבים בתרחיף תרחיף פרוטופלסטים תרחיף פרוטופלסטים מפרוטופלסטים בתרבית ניתן לקבל תרבית קלוס קלוס הכנת תרבית סטרילית במנדף סטרילי מיוחד לתרבית תאים 7
צילום מיקרוסקופ אלקטרוני של תרבית קאלוס תנאי הגידול מצע המזון עובר עיקור. הוא מכיל : מקור פחמן ( גלוקוז א וסוכרוז) מקור חנקן מקור זרחן מלחים ויטמינים הורמונים מווסתי צמיחה במינון המתאים: אוקסין ציטוקינין ג'ברלין מזון מן החי – חלב קוקוס או תמצית שמרים אגר למיצוק המצע (בתרבית על מוצק) חומר אנטיבקטריאלי הרכב מצע הגידול : צילום מיקרוסקופ אלקטרוני של תרבית קאלוס http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29a.htm תאים צמחיים אינם דורשים משטח מוצק לתאחיזה תאים צמחיים בעלי דופן צלולוז תאים צמחיים הם גדולים 100 מיקרון גידול איטי . זמן דור 20-40 שעות אסור ערבול ,לכן הערבול ע"י איוורור או ע"י המצע חובת שמירה על סטריליות ומניעת זיהום חיידקי / נגיפי אוויר (חמצן ) - התאים אירובים טמפרטורה אופטימאלית 20 – 28 מעלות צ. PH מצע מעט חומצי 5 – 6.5 תאורה או חושך ( תלוי בתרבית ) טלטול על SHAKER ( בתרבית תאים ) מאפיינים של גידול תאים צמחיים : קאלוס שהתחיל להתמיין בפריפריה http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29a.htm הגדרת אינוקולום : הרקמה הנזרעת. מקור וגודל האינוקולום קובעים את ההתפתחות של התרבית. 8
שחזור צמח שלם בשתי דרכים 2 1 רקמת צמח תאים צעירים (לא ממוינים) תאים בוגרים (סומאטיים) קלוס על מצע מוצק פרוטופלסטים בתרחיף במצע נוזלי צמחים משוחזרים מתרבית קלוס ישירות או דרך פרוטופלסטים עוברים שינויים גנטיים ספונטאניים הנקראים ואריאציות סומאקלונליות Somaclonal variation התמיינות תאי קאלוס ע"י הורמונים צמחיים באגר תכונה בלעדית אך ורק לצמחים: יכולת שחזור צמח שלם מתא סומאטי בתרבית 9 מתקבל צמח משוחזר
שלבים בהתפתחות צמח מקלוס http://www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/introduction.htm גידול על מצע מזון + מווסתי גידול (הורמונים צמחיים אוקסין וציטוקין ) יגרמו לתרבית קאלוס להתמיין ולפתח ניצרון (ממנו מתפתח הגבעול ) ושורשון (ממנו מתפתחים השורשים) וליצור בחזרה צמח שלם . 10
השפעת הורמונים צמחיים על התפתחות קלוס העשרה השפעת הורמונים צמחיים על התפתחות קלוס עודף אוקסין מעודד צמיחת השורשים עודף ציטוקינין מעודד צמיחת הגבעולים יחס שווה מעודד גידול הקלוס השפעת הורמונים צמחיים על קלוס http://arabidopsis.info/students/1998-9/peter/regenerationGM.html 11
שחזור צמח שלם מתרבית קלוס בהשפעת הורמונים העשרה שחזור צמח שלם מתרבית קלוס בהשפעת הורמונים התמיינות רקמת קלוס התפתחות ניצרון ושורשון ניצרון שורשון http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29a.htm בהשפעת מצע הגידול והורמוני הצמיחה ( ציטוקינין 0.2 מ"ג לליטר ואוקסין 3 מ"ג לליטר) : נוצר הקלוס. בנוכחות עודף אוקסין : תהיה התמיינות לשורשון (ציטוקינין 0.02 מ"ג לליטר ואוקסין 3 מ"ג לליטר ) בנוכחות עודף ציטוקינין : תהיה התמיינות לניצרון + עלים ( ציטוקינין 1 מ"ג לליטר ואוקסין 0.03 מ"ג לליטר ) 12
העשרה Callus cultures derived from onion Banana protoplasts 13 http://www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/uses.htm http://www.fao.org/documents/show_cdr.asp?url_file=/docrep/007/ae216e/ae216e0c.htm 13
העשרה 14 רשימת אתרים להרחבה תרביות תאי צמח http://www.accessexcellence.org/LC/ST/st2bgplant.html http://hort201.tamu.edu/YouthAdventureProgram/TisueCulture/TissueCulture.html http://www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/introduction.htm פרוטופלסטים ותרביות צמחיות http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29c.htm תרשים תרביות צמחים מפרוטופלסטים ומקלוס http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e34/2.htm הורמונים צמחיים - אוקסינים וציטוקינינים http://www.edu-negev.gov.il/nagar/self/info/hormonim.htm http://www.edugal.org.il/hokrim/concept/mu014.htm http://www.edu-negev.gov.il/nagar/self/info/maagargor.HTM שחזור צמח ( רגנרציה ) בתרבית והשפעת הורמונים צמחיים על קלוס http://arabidopsis.info/students/1998-9/peter/regenerationGM.html http://www.wtcc.wur.nl/uk/Technologies/Regeneration.htm 14