4. Modellierung der Genregulation 8. Vorlesung 4. Modellierung der Genregulation 5. Metabolic Pathways / Signal Pathways Vorlesung WS 06/07 Modellierung & Simulation Überblick

Identifizierung von Transkriptionseinheit – naiver Ansatz: -    Identifikation der Start- und Stopptripletts; -    Identifikation der Intron/Exon-Grenzen; -    Identifikation der Promotoren; -    Identifikation der Terminatorsequenzen; -    Identifikation der Shine-Dalgarno-Sequenz. Identifikation dieser Strukturen ausreichend ? Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

RNA-Polymerase von Prokaryonten unterteilt sich in: - Sigmafaktor und Prokaryonten: Automatische Identifikation der Promotoren leichter, weil die sequenzierten Promotoren statistisch eine einheitliche Sequenz aufweisen. Eukaryonten: Hier kennt man eine Vielzahl von Signalen, die in einer unüberschaubaren Kombination auftreten. RNA-Polymerase von Prokaryonten unterteilt sich in: - Sigmafaktor und - Core-Enzym. Sigmafaktor identifiziert den Promotor. Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Mindestlänge der Subsequenzen ? Solche Signale kommen in allen Promotoren vor; deshalb bezeichnet man sie auch als konserviert. Überlagerung aller bekannten Promotoren  Consensus-Sequenzen ablesen. Faustregel: Je ähnlicher die jeweiligen Promotorabschnitte den Consensus-Sequenzen sind, desto stärker ist der Promotor und umgekehrt. Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Prominenteste Bindungsstelle: Pribnow Box Stormo: Veranschaulichung der Problematik Pribnow gibt die folgenden Bindungssequenzen an: TACGAT TATAAT TGTAAT GATACT TATGAT TATGTT Konsensussequenz: TATAAT Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Statistik – Auftreten dieser Sequenz im Genom: Konsensussequenz: TATAAT Gleichverteilung der Basen: 4096 bp Mismatch zulassen: 170 bp Zwei Mismatchs zulassen: 34 bp Verwendung von TATRNT Mismatch zulassen: 28 bp Stormo (2000) Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Quantitative Modellierung (zwei Ansätze) Ziel: Approximation der Bindungsenergien Matrix-Ansatz Positionsabhängige Beschreibung von Nukleotidhäufigkeiten. Oligonukleotid-Ansatz Positionsabhängiges bestimmen häufiger Teilsequenzen. Häufigkeitsmatrix  Wahrscheinlichkeitsmatrix Abstrakte Gewichte  Gewichtsmatrix Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Alignment von Bindungssequenzen des Faktors E12 C C A A C A C C T G C T G C C T T T G C A C C T G C T G C G C T G A C A C C T G T T A C C T C G C C A C C T G C T G G T T C C T C A C C T G C C T T A G G G C C A C C T G C C T A G Häufigkeitsmatrix (Stormo und Schneider 1982) A 0 0 1 2 0 6 0 0 0 0 0 1 1 1 C 2 3 1 2 6 0 6 6 0 5 2 0 3 2 G 1 1 3 1 0 0 0 0 6 0 0 3 1 2 T 3 2 1 1 0 0 0 0 0 1 4 2 1 1

Alignment von Bindungssequenzen des Faktors E12 C C A A C A C C T G C T G C C T T T G C A C C T G C T G C G C T G A C A C C T G T T A C C T C G C C A C C T G C T G G T T C C T C A C C T G C C T T A G G G C C A C C T G C C T A G Wahrscheinlichkeitsmatrix A 0 0 17 33 0 100 0 0 0 0 0 17 17 17 C 33 50 17 33 100 0 100 100 0 83 33 0 50 33 G 17 17 50 17 0 0 0 0 100 0 0 50 17 33 T 50 33 16 17 0 0 0 0 0 17 67 33 17 17

Modellierung - Genexpression der Eukaryonten Drei unterschiedliche Arten von RNA-Polymerase - RNA-Polymerase I Transkription der rRNA Gene - RNA-Polymerase II Transkription der tRNA Gene - Polymerase III Transkription der mRNA Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Modellierung - Genexpression der Eukaryonten Unterteilen sich in: - zwei große und zehn kleine Untereinheiten sowie - Transkriptionsfaktor zur Initiierung der Bindung Promotoren der Polymerase II – modulartig aufgebaut. Module sind bisher bruchstückhaft erforscht. Einige Module weisen ebenfalls Konsensus-Sequenzen auf. Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

TATA- oder Hogness-Box Bekannte Module: TATA- oder Hogness-Box Ähnelt der Pribnow-Box, doch im Gegensatz zu jener befindet sie sich bei Eukaryonten-Promotoren gewöhnlich ca. 25 bp stromaufwärts vom Startpunkt. Dies ist die einzige Box, deren Lage zum Startpunkt relativ fest ist. CAAT-Box In mehreren bekannten Promotoren vorhanden. Oft 80 bp stromaufwärts vom Startpunkt, aber ihre Position hat für die Funktion keine Bedeutung. Diese Box kann innerhalb eines Promotors mehrfach auftreten. Weiterhin ist auch ihre Orientierung nicht festgelegt. GC-Box Enthält oft die Sequenz GGGCGG. Sie kommt ebenfalls mehrfach innerhalb eines Promotors vor, wobei ihre Positionierung und Orientierung beliebig sein kann. Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Vergleich mit Prokaryonten-Promotoren: Anzahl und Lage der Module sowie die Anordnung der Basen innerhalb der Module in jedem Eukaryonten-Promotor sind verschieden. Erfordert eine große Kooperation unter den verschiedenen Transkriptionsfaktoren. Sie dienen zur Initiation und Termination der Transkription. Enhancer wirken unterstützend. Wechselwirkung von Enhancer und Promotor ist nicht aufgeklärt. Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

TF-Stellen in einem Promotor erscheinen willkürlich verteilt. Modul Untereinheiten des Promotors oder Enhancers, die aus mehreren synergetisch wirkenden TF-Stellen bestehen und eine übertragbare Funktion ausüben. Promotor-Modul TF-Stellen in einem Promotor erscheinen willkürlich verteilt. Ordnung der TF-Stellen innerhalb eines Promotor-Moduls. Funktionalität eines Promotors ergibt sich aus: Kombination von Modulen ! Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Erkennung von Promotoren Ebene 1 Methode Erkennung einzelner TF-Stellen. a) Konsensus-Sequenzen (Ja/Nein-Entscheidung) b) Verteilungssequenzen (quantitative Beurteilung) Problem: TFs kaum länger als 10-20 Nukleotide. TFs nicht die einzigen Elemente der Transk-Kontrolle. Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Erkennung von Promotoren Ebene 2 Methode Umgebung entscheidet über die Funktion. Kombination von TF-Bindungsstellen ist von Bedeutung. Vorlesung Modellierung & Simulation 4. Modellierung

Nukleotid -Verteilung Trainings-Sequenz A C G T A A C A C A A T T A A A T C T A A C A T G A T C C G Pos 1 2 3 4 5 A C G T 0 2 1 4 0 3 2 2 0 0 0 1 0 2 0 3 1 3 0 IUPAC Consensus: A Y N Y R Test-Sequenzen: Matrix IUPAC A C C T A 18 JA A C C G A 17 NEIN T C C T A 12 NEIN

Metabolic Pathways - Enzymkinetik Reaktionsgeschwindigkeit v für die Umwandlung einer Verbindung A  Produkt(e) (Reaktion erster Ordnung) ist proportional zur Konzentration der Verbindung [A]. Für die Reaktion zweier Verbindungen miteinander A + B  Produkt(e) (Reaktion zweiter Ordnung) ist die Konzentration beider Verbindungen von Bedeutung. Proportionalitätsfaktor k - Geschwindigkeitskonstante. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Gl 2 kann auf eine Komplexbildung und Gl 1 auf den Zerfall dieses Komplexes angewendet werden.   v = d[A] / dt = k * [A] Gl1 v = d[A] / dt = d[B] / dt = k * [A] * [B] Gl2 Dies gilt für: Substrat-Enzym-Komplexe, Ligand-Rezeptorkomplexe, Antigen-Antikörperkomplexe usw. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Enzymkatalysierte Einsubstratreaktionen: Annahme: Substrat und Enzym (der Katalysator, E) bilden durch eine reversible Reaktion einen Komplex. Dieser Schritt wird kinetisch wie eine Zweisubstanzreaktion behandelt (Geschwindigkeitskonstanten k1 und k-1 für Bildung bzw. Zerfall). Komplex wird in das Produkt (P) mit der Geschwindigkeitskonstante k2 umgewandelt. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Enzymkatalysierte Einsubstratreaktionen: S + E (k1,k-1) ES  (k2,k-2) EP  (k3,k-3) E + P Üblicherweise ist das Substrat in großem Überschuß über das Enzym vorhanden. In diesem Fall kann nach einer kurzen Anlaufzeit (transient phase) [ES] als hinreichend konstant angesehen werden (steady-state-Annahme). Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Annahme: Geschwindigkeitsbestimmender Schritt ist Reaktion ES  E + P  Anfangsgeschwindigkeit v0 (nach Anlaufzeit) als Funktion von [ES]:   v0 = k2 * [ES]. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

dann wird die maximale Reaktionsgeschwindigkeit Vmax erhalten: Gesamtkonzentration des Enzyms [Et] = [E] + [ES]. Wenn [ES] = [Et], dann wird die maximale Reaktionsgeschwindigkeit Vmax erhalten: Vmax = k2 * [Et] Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Definiert man zusätzlich die Michalis-Konstante KM mit KM = k-1 + k2 / k1 so erhält man die sogenannte Michaelis-Menten-Gleichung: v0 = Vmax * [S] / KM + [S]   Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Michaelis-Menten-Gleichung Zeigt die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration (Reaktion erster Ordnung). Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration liefert eine rechtwinklige Hyperbel.  Formel betrachtet nur die Hinreaktion. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Definition der Enzymaktivität Substratmenge, die pro Zeiteinheit in Anwesenheit einer bestimmten Menge Enzym umgesetzt wird. Wechselzahl eines Enzyms Zahl der Substratmoleküle, die von einem Enzymmolekül in der Zeiteinheit umgesetzt werden, wenn das Enzym mit Substrat gesättigt ist ([Et] = [ES]). Identisch mit k2 und kann als k2 = Vmax/[Et] ermittelt werden. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Kombination einiger Gleichungen: v0 = k2 / KM * [E] * [S] k2/KM = wie oft ein Kontakt von Enzym/Substrat zu einer Reaktion führt. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Enzymhemmung Kompititive Hemmung Ks = [E] * [S] / [ES] Inhibitor konkurriert reversibel mit dem Substrat um die Bindestelle am aktiven Zentrum des Enzyms. Enzym-Substrat- und Enzym-Inhibitorkomplexe haben die Dissoziationskonstante Ks bzw. Ki. Ks = [E] * [S] / [ES] Ki = [E] * [I] / [EI] Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Unkompetitive Hemmung Enzymhemmung Unkompetitive Hemmung Inhibitor reagiert reversibel nur mit dem Enzym-Substratkomplex, hindert aber nicht seine Bildung. Die Dissoziationskonstante ist K‘i. K‘i = [ES] * [I] / [ESI] Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Zweisubstrat-Reaktionen Reaktionskinetiken: Gleiche Annahmen wie für die Einsubstrat- Reaktionen. Form hängt von der Reaktionssequenz ab. Für den Umsatz jedes der beiden Substrate gibt es eine eigene Michaelis-Konstante. Nomenklatur-System nach Cleland benutzt die folgenden Ausdrücke für die Anzahl der Substrate und Produkte der Reaktion: 1 - Uni, 2 - Bi, 3 - Ter, 4 - Quad. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Substrate werden mit A,B,C ... bezeichnet, Produkte mit P,Q, R ... und die Enzymspezies (Ausgangszustand, Zwischen-, End-) mit E,F,G. Sequentielle Reaktion: Alle Komponenten müssen sich aneinander binden, bevor die Reaktion erfolgt. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

a) ordered sequential Bi-Bi Ping-Pong-Reaktion: Wenn das eine Substrat das Enzym verlässt, bevor das andere Enzym bindet. a) ordered sequential Bi-Bi A B P Q E EA EAB EPQ EQ E Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

b) Random sequential Bi-Bi A----EA----B P---EQ----Q ----E-------------EAB  EPQ----------------------E--- B-----EB---A Q----EP---P c) Ping-Pong Bi-Bi A P B Q ---E-----EA  FP------F----FB  EQ-----------E---

Formel für geordnet sequentielle Bi-Bi-Reaktion: 1 / v0 = 1 / Vmax + (KM)A / Vmax* [A] + (KM)B / Vmax * [B] + (KM)AB / Vmax* [A] * [B]   Formel für Ping-Pong Bi-Bi-Reaktion: 1 / v0 = 1 / Vmax + (KM)A / Vmax*[A] * (KM)B / Vmax* [B] Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Geschwindigkeitsabhängigkeit: - Temperatur und - Aktivierungsenergie. Betrachtung der Reaktionssequenz zeigt: - Kollisionen oberhalb einer gewissen Stoßenergie kommen zur Komplexbildung (ES oder EP). - Umwandlung ES  EP benötigt primäre Energiezufuhr. - Reaktionen haben Energiebarrieren zu überwinden. Die höchste Barriere bestimmt die Reaktionsgeschwindigkeit und wird der Gesamtbetrachtung zugrundegelegt. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Fraktale Enzymkinetik:   Die betrachteten Ableitungen basieren auf idealen Voraussetzungen: Gereinigte Enzyme, niedrige Konzentrationen, freie Beweglichkeit der Reaktionsteilnehmer,… Situation in vivo ist verschieden. Hauptaussagen: - KM hängt von der Enzymkonzentration ab, sie sinkt bei steigender Enzymkonzentration. ­ Auftragen der Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substanzkonzentrationen liefert eine Tendenz zu sigmoiden Kurven auch bei monomeren Enzymen. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Enzyme: Erhöhen Reaktionsgeschwindigkeit um den Faktor 1015. Sie zeigen: Substratspezifität und Reaktionsspezifität. Katalytische Mechanismen Jede Umwandlung von einem Molekül in ein anderes erfordert zuerst Zufuhr von Energie (Aktivierungsenergie). Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Einsubstrat-Reaktion Enzymkatalysierte Reaktion, die ein einziges Substrat (S) umsetzt. Molekül bindet an das Enzym (E) und bildet den Enzym-Substrat-Komplex (ES). Dann erfolgt die Umwandlung zum Produkt (P), das danach freigesetzt wird. Das Enzym kann jetzt den nächsten katalytischen Zyklus beginnen: E+S  ES  EP  E + P Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Zwei-Substrat-Reaktion: Enzym und beide Substrate können einen ternären Übergangskomplex (EAB) bilden. Nach Beendigung der katalysierten Reaktion verlassen die Produkte den Komplex. Substrat A kann mit dem Enzym E in Kontakt treten und es auf bestimmte Weise verändern. Dann wird A als Produkt P freigesetzt, bevor das Substrat B mit dem modifizierten Enzym F reagiert. Teil des Enzyms ist das katalytische Zentrum. Es dient: - der Erkennung und - der Katalyse. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Typische katalytische Mechanismen: - Abspaltung oder Anlagerung von Protonen, - Bildung von kovalenten Bindungen, - elektrostatische Effekte, - Orientierungs- und Nachbarschaftseffekte sowie - Verformung der gebundenen Substrate zu einer Konfiguration, die dem Übergangszustand entspricht. Co-Faktoren - z.B. Coenzyme Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

 Charakteristischer pH-Wert - Aktivität ist maximal. pH-Effekte: Substratbindung und Katalyse in Abhängigkeit positiv oder negativ geladener Aminosäuren.  Charakteristischer pH-Wert - Aktivität ist maximal. Temperatureffekte: Bei Säugern liegt das Optimum bei 40° - 50°. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Mehrere einzelne Enzyme können zu einem Multienzymkomplex assoziieren. Multienzymkomplexe Zwei oder mehr Enzymaktivitäten können auf einer einzigen Polypeptidkette lokalisiert sein, die dann mehrere aktive Zentren enthalten (multifunktionale Enzyme). Mehrere einzelne Enzyme können zu einem Multienzymkomplex assoziieren. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Enzyme - Klassifikation EC-Liste beruht auf einem dezimalen Klassifizierungssystem mit - Klassen, - Unterklassen, - Unter-Unterklassen und - einzelnen Enzymbezeichnungen. Neben den systematischen sind häufig auch Trivialbezeichnungen zugelassen, die leichter handhabbar sind. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Das System ist folgendermaßen aufgebaut: 1 Oxidoreuktasen 1.1 Reaktion mit der CH-OH-Gruppe von Donoren 1.1.1 mit NDA+ oder NADP+ als Akzeptor 1.1.2 ... 1.2 Reaktion mit der Aldehy- und Oxogruppe von Donoren ... 2 Transferasen 2.1 Übertraung von Ein-Kohlenstoff-Gruppen 2.2 Übertragung ... 3 Hydrolasen 3.1 Reaktion mit Esterbindung, 3.2 Glycosidasen … 3.12 Reaktion mit Schwefel-Schwefel-Bindung

4 Lyasen 4.1 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen 4.99 andere   5 Isomerasen 5.1 Racemasen und Epimerasen 5.99 andere 6 Ligasen 6.1 Bildung von Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen ... 6.5 Bildung von Phosphatesterbindungen

IUBMB EC 1.*.*.* Oxidoreductases EC 2.*.*.* Transferases ... EC 1.1.*.* Acting on the CH-OH group of donors EC 1.3.*.* Acting on the CH-CH group of donors EC 1.1.1.* With NAD or NADP as acceptor EC 1.1.2.* With a cytochrome as acceptor EC 1.1.1.1 alcohol dehydrogenase EC 1.1.1.2 alcohol dehydrogenase (NADP) The 4-digit EC number, d1.d2.d3.d4 represents a sub-sub-subclass indication of biochemical reaction. For instance, arginase is numbered by EC 3.5.3.1, which indicates that the enzyme is a hydrolase (EC 3.*.*.*), acts on the “carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds” (sub-class EC 3.5.*.*) in linear amidines (sub-sub-class EC 3.5.3.*).

Enzymatisches Netzwerk Netzwerk enzymatischer Reaktionen. Möglichkeiten der Beschreibung: - Substrat/Enzym/Produkt Relationen, - Enzymkinetik und - Co-Faktoren. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Metabolic engineering Metabolismus lebender Zellen ist ein hoch vernetztes System von biochemischen Prozessen, die durch Gene und Prozesse der Zellkommunikation gesteuert werden. Forschungsbereich des metabolic engineerings entwickelt praktische und theoretische Methoden zur Analyse und Steuerung metabolischer Prozesse. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Ecology Individual Moderne Biologie Systems Biology Organ, Tissue Physiology Biochemistry Genes Reaction Kinetics Molecular Structure Gene Sequences Gene Expression Transcription Factors

Biochemische Pathways wurden immer im Kontext der historischen Entdeckung definiert (z.B. Glycolyse oder UREA Zyklus oder Pentose Phosphat Pathway). A biochemical pathway is an abstraction of a subset of intricate networks in the soup of interacting biomolecules (Mavrovouniotis, 1995). A B C Reality: Abstract: E1 E2 gene1 gene2

Weiterhin bezeichne fi  F eine Funktion R (R  M) in P (P  M): Sei M = {m1, m2 …., mn} eine beliebige Menge von Metaboliten. Bezeichne F : M  M eine beliebige Funktion von Bioprozessen. Weiterhin bezeichne fi  F eine Funktion R (R  M) in P (P  M): fi : R  P Für alle m1, m2, m3  M gilt: f1(m1) = m2 and f2(m2) = m3  f2(f1(m1)) = m3 Sei f1(m1) = m2, f2(m2) = m3, …., fk(mk) = mk+1, dann gilt f1f2…fk (m1) = fk(fk-1…f1(m1)) = mk+1. Definition: Ein metabolic pathway ist ein subset von successive enzymatic reaction events P = e1e2…ek. Metabolic Pathway: Sequence of enzymatic reactions Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Jeder Organismus hat seine spezifische Menge an Pathways: - Energie produzieren, - Synthese der Moleküle benötigt (u.a. Aminosäuren) ...   Zelle als chemische Maschine - zwei Hauptkomponenten: 1. Eine Komponente, die Aminosäuren produziert. 2. Eine zweite, die Energie liefert. Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways

Appl. 1: pathway evolution: pathways from different organisms

Signal Pathways

Ein Klassifikationsschema für Signal Pathways und verwandte Reaktionen. Eine four-digit ST Nummer d1.d2.d3.d4 bezeichnet einen Signal Pathway mit: d1 := location of transduction d2 := type of interaction d3 := signal molecule's nature d4 := ID

The sub-class notations are briefly described as d1 = 1: Extracellular signal reception events d2 = 1: Physical stimulation of receptors d2 = 2: Binding with hormones d2 = 3: Binding with non-GF cytokines d2 = 4: Binding with Growth Factors d2 = 5: Binding with neuronal receptors d2 = 6: Binding with other ligands d1 = 2: Plasma membrane transduction events ... d1 = 3: Plasma membrane to cytoplasma transduction events d1 = 4: Intracellular signal transduction events d2 = 1: Ser/Thr phosphorylation d2 = 2: Tyr phosphorylation d2 = 3: Other phosphorylation d2 = 4: Dephosphorylation d2 = 5: Ubiquitination d1 = 5: Cytoplasma to nucleoplasma transduction events … d1 = 6: Nucleoplasma to nucleoplasma transduction events

Die Signal Transduction Classification Database (STCDB) WWW: http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/stcdb 2004 Update: HTML -> PostgreSQL Vorlesung Modellierung & Simulation 5. Pathways