2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze 2.2.2. Ausglühen und Abflammen mit Bunsenbrenner

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze Bunsenbrenner so einstellen (Luft), dass eine nichtleuchtende, hellblaue Flamme im Innenkegel und eine helle, orange-gelbe Flamme im Außenkegel entsteht Innenkegel mit ca. 300 °C: stark reduzierende Bedingungen am Übergang zum Außenkegel Außenkegel mit bis zu 1500 °C: stark oxidierende Bedingungen an der Spitze

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze Ausglühen für Impfnadeln, Impfösen, Klingen, Scheren, Präpariernadeln, Pinzetten, … diese werden durch den äußeren Teil des Flammenkegels gezogen bis sie glühen Temp. von ca. 1000 °C Mikroorganismen werden innerhalb von Sekundenbruchteilen getötet – steril Material leidet, Klingen verlieren Schärfe

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze Abflammen für Metall-, Porzellan-, Glasgeräte (z.B. Drigalski-Spatel) oberflächliche Sterilisation Gegenstand wird durch die Flamme gezogen, ohne ihn zum Glühen zu bringen tw. unter Zuhilfenahme von 96%igem EtOH: Eintauchen + Abflammen (Spatel) früher weit verbreitet, heute eher Notbehelf

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion Sterilisation durch Gase: Ethylenoxid für hitzeempfindliche Produkte sehr giftig, explosionsgefährlich nicht immer rückstandsfrei (Filter) im Labor nicht/selten verwendet Desinfektion durch chemische Mittel Desinfektionsmittel genannt für Oberflächen: Medizin gegen Krankheitserreger, Labor/Industrie möglichst breit gegen alle Keime Keimreduktion um 5 Zehnerpotenzen angestrebt (99,999%)

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion Fertigprodukte (optimiert für ein bestimmtes Einsatzgebiet): z.B. Sterilium, … 70%iger EtOH (Verdünnung 96% EtOH) Kontrolle z.B. Filterplättchentest Wirksamkeit abhängig von: Schmutz-, Fett-, anderen Begleitstoffen pH-Wert Temperatur Ausgangskeimzahl

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion Händedesinfektion Waschen mit Seife reduziert Keimzahl um 60 bis 80 Prozent Desinfektion zumeist auf Alkoholbasis 70% Ethanol (nicht 96%) 70% 2-Propanol 60% 1-Propanol (n-Propanol) Fertigdesinfektionsmittelgemisch: „Sterilium“ am schnellsten keimtötende Verbindungen: vegetative Zellen bereits nach 30 bis 60 sek abgetötet Wirkung 1 bis 2 Stunden

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion Anleitung

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.4. Bestrahlung nur mit energiereicher, ionisierender Strahlung möglich (dringt tief genug ein) Gammastrahlung z.B. für medizinische Artikel (Spritzen, Kanülen, Katheter, Verbandmaterial), aber auch in der pharmazeutischen Industrie für z.B. Verpackungsmaterialien in der mikrobiologischen Praxis nur UV-Bestrahlung relevant: meist zur Verminderung der Keimzahl in Raumluft und an Oberflächen eingesetzt

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.4. Bestrahlung für Werkbänke, Arbeitsflächen, Laminar-Flows v.a. UV-C Strahlung eingesetzt (200-280 nm) Optimum bei ca. 260 nm, da Nukleinsäuren in diesem Bereich absorbieren – strukturelle Veränderungen der DNA (kovalenter Ringschluss zw. Pyrimidin-Basen) und Replikationsfehler (Zelltod) Beim Einsatz von UV-Strahlung zur Desinfektion muss auf Staubfreiheit geachtet werden

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration zur Entkeimung thermolabiler Substanzen (z.B. Antibiotikalsgen, Vitaminlsgen, …) und Gasen für Entfernung von Partikeln in Lsgen Entgasen von Lsgen mittels Oberflächenfiltern: aus Cellulose, Celluloseestern, Kunststoff (PTFE (Polytetrafluorethylen), Teflon, …) dünne Membranen regelmäßige Poren mit gleichmäßigem Durchmesser (v.a. 0,2 µm und 0,45 µm eingesetzt) wirken wie ein Sieb und halten die Partikel an der Oberfläche kaum Wirkung gegen Viren, dünne Bakterienzellen, DNA hohe Durchflussleistung leicht verstopft

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration mittels Tiefenfiltern: entweder aus feinen Fasern (Cellulose-, Keramik-, Kunststofffasern), die regellos miteinander verbunden sind oder aus körnigem, meist gesintertem Material (Kieselgur, Keramik, Glassinter) dick geschichtet (bis in Meterbereich) labyrinthartiges Hohlraumsystem kein einheitlicher Porendurchmesser Partikel v.a. in der Tiefe des Filters zurückgehalten: mechanisch, Adsorption, elektrostatische Kräfte auch Partikel, die kleiner sind als der Porendurchmesser, können zurückgehalten werden geringe Durchflussraten (ca. 40 mal geringer als bei Oberflächenfiltern) Hallenbäder

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration Sterilfiltration von Flüssigkeiten (Oberflächenfilter): im Labor meist mit sterilen 0,2 µm Membranfiltern aus hydrophilem Material (v.a. Cellulosenitrat, Celluloseacetat) Verwendung von größer-porigen Vor-Filtern „Auswaschen“ von verschiedenen Stoffen aus dem Filtermaterial möglich: z.B. bei Nitratbestimmung keine Cellulosenitrat-Filter verwenden Filtrationsgeräte (Filterhalter, Schläuche, Gefäße) werden separat (dampf)sterilisiert

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration Durchführung: meist wird im Auffanggefäß ein Unterdruck erzeugt (Vakuumpumpe), die aufgesetzte, sterile Filtereinheit mit der Flüssigkeit beschickt und letztere durch den Unterdruck über einen Membranfilter in das Auffanggefäß gesaugt Aufsetzen der Filtriereinheit muss unter aseptischen Bedingungen erfolgen Verschluss ebenfalls unter aseptischen Bedingungen ODER: sterile Fertigfilter mit 0,2 µm Porendurchmesser für kleine Volumina

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration Filtriereinheit

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration Filtriereinheit

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration Sterilfiltration von Gasen: Tiefenfilter im Labor für Belüftung oder Begasung von Kulturen notwendig für Kleinfermenter meist Watte- oder Glaswollefilter ein Glasgefäß, -röhrchen o.Ä. wird mit Watte/Glaswolle (bis 6 µm Faserdurchmesser) gleichmäßig und fest gestopft Material sollte hydrophob sein (wenig Flüssigkeitsaufnahme (z.B. Aquarienwatte)) Durchmesser 1 bis 3 cm, Länge 5 bis 20 cm, je nach Verwendung Länge abhängig vom beabsichtigten Durchfluss gestopfte Filter autoklavieren

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.5. Sterilfiltration Gase:

3. Steriles Arbeiten Ziele: Hauptkontaminationsfaktoren: Sterile Nährböden, Lösungen und Geräte vor Kontamination schützen Reinkulturen „rein“ halten die Umwelt (Raum, Personen,...) vor Infektionen durch Versuchsorganismen schützen Hauptkontaminationsfaktoren: Luft viele Organismen sind luftgetragen (Sporen) „normale“ Raumluft mit bis zu 2000 (2 x 103) Keimen (zumeist an/auf Staubpartikeln) Mensch (Hände, Haare,…) Staub „Tröpfcheninfektion“ unsteriles Arbeitsgerät Öffnen von sterilem Material (sterile Spitzen) etc. in unsteriler Umgebung

3. Steriles Arbeiten 4 Risikogruppen für den Umgang mit pathogenen Mikroorganismen: Risikogruppe 1: kein Risiko (oder sehr geringes) Risiko für (gesunde) Menschen und Wirbeltiere Risikogruppe 2: geringes (bis mäßiges) Risiko für Menschen und Wirbeltiere. Potentielle Krankheitserreger, die aber wirksam behandelt werden können Risikogruppe 3: mäßiges bis hohes Risiko, Erreger schwerer Krankheiten beim Menschen, Behandlung normalerweise möglich Risikogruppe 4: hohes Risiko für den Menschen, Behandlung oft schwierig

3. Steriles Arbeiten 4 Risikogruppen - Beispiele: Gruppe 1: Bacillus subtilis, E. coli K12 (Laborstamm), Lactobacillus casei, Micrococcus luteus; Aspergillus niger, Geotrichum candidum, Penicillium chrysogenum Gruppe 2: Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, E. coli; Aspergillus flavus, Candida albicans, Aspergillus fumigatus Gruppe 3: Bacillus anthracis, E. coli (EHEC-Stämme), Yersinia pestis; Histoplasma capsulatum var. capsulatum Gruppe 4: bestimmte Viren Mit Organismen der Risikogruppen 2 bis 4 darf nur in genehmigten und dafür eingerichteten Labors gearbeitet werden