INITIALE ERFAHRUNGEN MIT DER MAKROPHAGENABLATION ALS NEUES TOOL FÜR DIE MOLEKULARE BILDGEBUNG Bastian O T Sabel 1,2, Tobias Bäuerle 1, Karsten Brand 2, Wolfhard Semmler 1, Soenke H Bartling 1 Für die Molekulare Bildgebung ist die Phagocytose durch Makrophagen des retikuloendothelialen Systems in zweierlei Hinsicht relevant: 1.Sie wird zur Anfärbung von makrophagenreichem Gewebe wie der Leber genutzt. Da Tumore die Fähigkeit zur Phagocytose verlieren, reichern sie kein Kontrastmittel an und können so vom gesunden Gewebe unterschieden werden. 2. Die unspezifische Phagozytose durch Makrophagen verringert die Zirkulationszeit von größeren Kontrastmitteln, was die Anwendung von komplexeren (bsp. multimodalen oder getargeteten) Kontrastmitteln erschwert. Das Ziel dieser Studie war, die Makrophagenablation in die molekulare Bildgebung einzuführen und ihr Potential zur Manipulation von Kontrastmittelkinetiken zu demonstrieren. 1 Abteilung Medizinische Physik in der Radiologie, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Deutschland 2 Dept. of Radiology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA 3 Pathologisches Institut, Universität Heidelberg, Heidelberg, Deutschland EINFÜHRUNG Drei Tage nach der Clodronatapplikation wurden 200 µg des partikulären Kontrastmittels ExiTron nano 6000 intravenös appliziert. Die Kontrastmittelkinetik wurde mittels wiederholter CT-Scans in makrophagenabladierten Mäusen mit der unbehandelten Kontrollgruppe verglichen. DISKUSSION PARTIKULÄRES KONTRASTMITTEL UND fpVCT-SCANS Die Makrophagenablation wurde immunohistologisch verifiziert. (8 Makrophagen pro Gesichtsfeld (max 15,7/min 0,7) nach Ablation, gegenüber 33,5 (max 43,3/ min 25,7) in der Kontrollgruppe). Die Kontrastmittelanreicherung in der Leber und in der Milz nahm sowohl in makrophagenabladierten Mäusen als auch in der Kontrollgruppe im Zeitverlauf zu. Jedoch unterschieden sich die Maximalwerte in der Leber mit 218 CTV (min 184/max 252) in behandelten Mäusen von denen der Kontrollgruppe mit 622 CTV (min 480/max 805) signifikant. Ähnliches wurde auch in der Milz beobachtet: 443 CTV (min 350/max 508) in der behandelten Gruppe verglichen mit 1017 CTV (min 523/max 1553) in der Kontrollgruppe. Die Kontrastmittelanreicherung in der Niere zeigte mit 74 CTV bei behandelten Mäusen und 71 CTV bei den Kontrollmäusen keine Unterschiede. Das Muskelgewebe wies ebenfalls keine Anreicherung auf. ERGEBNISSE REFERENZEN 1.) The effect of elimination of macrophages on the tissue distribution of liposomes containing [3H]methotrexate. Claassen E, Van Rooijen N., Biochim Biophys Acta Dec 20 2.) Transient suppression of macrophage functions by liposome-encapsulated drugs. van Rooijen N, Bakker J, Sanders A. Trends Biotechnol May;15(5): ) Clodronate Liposomes: Perspectives in research and Therapeutics, Nico van Rooijen and Esther van Kesteren-Hendrikx Die Makrophagenablation führt in makrophagenreichem Gewebe wie Leber und Milz zu einer signifikanten Verminderung der Kontrastmittelanreicherung, jedoch zu keinen Unterschieden in makrophagenarmen Organen wie beispielsweise der Niere. Es folgt daraus, dass die Makrophagenablation die unspezifische Phagozytoseaktivität signifikant beeinflussen kann und damit neues Potential zur Erforschung und Modifikation der Aufnahme von Kontrastmitteln bereithält. In Tumormodellen könnte neue Erkenntnis über die Phagocytosefähigkeit von gutartigen bzw. bösartigen Tumoren gewonnen werden. Es könnte die Zirkulationszeit großer Kontrastmittelkomplexe soweit erhöht werden, dass ein erfolgreicher Einsatz möglich wird. Weiterhin könnten wertvolle Erkenntnisse im Zusammenhang mit der Planung neuer, gezielter Therapiekonzepte gewonnen werden. Die CT Untersuchungen erfolgten unmittelbar vor, sowie 3 min, 1 h, 6 h, und 24 h nach der ExiTron Applikation. Im Anschluss an die letzte Untersuchung wurden die Tiere getötet; Milz und Leber wurden jeweils für immunohistochemische Untersuchungen entnommen. Es erfolgte die Messung der relativen CT Werte (CTV) in mehreren Organe. MAKROPHAGENABLATIONS MODELL 3 h60 min 3 min In unserem Modell verwendeten wir mit jeweils 2 µg des Bisphosphonats Clodronat gefüllte Liposomen. Diese werden nach Injektion von körpereigenen Makrophagen aufgenommen und anschließend durch lysosomale Phospholipasen abgebaut. Die in den Liposomen eingeschlossenen Clodronat-Moleküle werden in den Zellraum freigesetzt. Sie akkumulieren dort, da ihnen die Fähigkeit fehlt, Zellmembranen zu überwinden. Ist eine bestimmte intrazelluläre Clodronatkonzentration erreicht, wird eine Apoptosereaktion provoziert. Fig.1: Mechanismus der Makrophagenablation mittels Clodronat-Liposomen (4) Fig.3: Schema eines ExiTron™ nano 6000 Nanopartikels (5 ) Fig.4: Siemens fpVCT Scanner Fig.5: Koronare CT-Schnittbildrekonstruktion von makrophagenabladierten Mäusen und Kontrollmäusen. Es zeigen sich deutliche Unterschiede der Kontrastmittelanreicherung in Leber und Milz im Zeitverlauf nach Injektion des partikulären Kontrastmittels. (CT-Fensterung: 1400 Fensterweite/ 180 Fensterposition) Drei Tage vor der Applikation des partikulären Kontrastmittels wurden die Clodronatliposomen in das Peritoneum von sechs weiblichen C57BL/6 Mäusen injiziert. Von dort migrieren diese zu lokalen Lymphknoten und gelangen über den Ductus thoracicus in den Blutkreislauf. Hierdurch wird eine Makrophagenablation in den Lymphknoten, im Blut, im Knochenmark, in der Milz und in der Leber erreicht. (Fig. 2)(4). Fig.2: Schema zur Macrophagenablation durch intraperitoneale Injektion von Clondronateliposomen 3 h60 min3 h 3 min 60 min3 h 3 min 60 min3 h 3 min 60 min3 h 3 min 60 min3 h 3 min 60 min3 h 3 min 60 min3 h 3 min 60 min3 h Fig.6: Die CTV‘s von Milz und Leber von makrophagenabladierten Mäusen (n=3, grüne Linie) und Kontrollmäusen (n=3, blaue Linie) zeigt signifikante Unterschiede der CT-Dichtezunahme durch Kontrastmittelanreicherung (Durchschnittswerte, max/min Werte im Text). Im Kontrast dazu zeigt die Niere keine Unterschiede, bzw. relevante Kontrastmittelanreicherung CTV Kontroll- gruppe 3 min60 min 3 h24 h Makrophagen abladiert Milz Leber 4.) 5.) Milz Niere Leber Immunhistochemische Makrophagenanfärbung mit CD68 Antikörpern Fig.7: Die CD68-Anfärbung von Kupffer Zellen in der Leber einer makrophagenabladierten Maus und einer Kontrollmaus zeigt eine deutliche Verringerung der Makrophagen (rötlich) nach Clodronat-Applikation Vor KM-Gabe vor KM-Gabe 3 min 60 min 3 h 6 h 24h Makrophagen Leber von C57BL/6-Maus nach Makrophagenablation Leber von C57BL/6-Maus aus Kontrollgruppe vor KM-Gabe 3 min 60 min 3 h 6 h 24h CTV