Chromatin im Säugerspermium

Aus Campbell S Testes: Säuger

Nach der Meiose: Spermienmorphogenese = Spermiogenese Alberts Fig 20-19, Spermium: Mensch Akrosom: mit Enzymen zur Durchdringung der Eizelle Mittelstück: Mitochondrien zur Energieproduktion Flagellum: Bewegung

Spermatogenese: Zellen sind durch Cytoplasmabrücken verbunden (Zeitangaben: Mensch) Die Spermatogenese ist die Bildung von Spermien, also männlichen Keimzellen Spermienmännlichen Phasen der Spermatogenese: 1)Mitotische Teilung der Spermatogonien zur Vermehrung der Keimzellen 2) deren Differenzierung zu den primären Spermatozyten = Spz1 Diese Phase ist mehrtägig und zeichnet sich durch erhebliche Zellvergrößerung aus 3) Erste meiotische Teilung der Spz1zu den Spz2 (2.Ordnung), zweite.Meiotische Teilung zu den runden Spermatiden = rSpd 4) Keine Teilung mehr, nur Differenzierung zu reifen Spermatiden = eSpd, sog. Spermiohistogenese oder Spermiogenese (englische Sprachgebrauch) Mehrtägige bis mehrwöchige Phase Während dieser als Spermiohistogenese (Spermiogenese)bezeichneten Entwicklungsphase werden Histone gegen Protamine ausgetauscht.

Figure Model for the packing of chromatin and the chromosome scaffold in metaphase chromosomes. In interphase chromosomes, long stretches of 30-nm chromatin loop out from extended scaffolds. In metaphase chromosomes, the scaffold is folded into a helix and further packed into a highly compacted structure, whose precise geometry has not been determined. Aus: Molecular Cell Biology, 4. Edition, Lodish et. al. Chromatin im Soma

Packaging chromatin: somatic cells and mammalian sperm from Braun Nature 2001

Structure of the sperm chromatin modified after Braun, 2001 Balhorn et al., 1999

Reduzierte Menge an Protaminen Sterilität beim Säuger

Homo sapiens & Säugetiere Transitionsproteine und Protamine Argenine-Cluster und viele Cysteine

Wie kommen Doughnuts zustande ?? Protamine haben viele Cysteine, zwischen Cysteinen können S-Brücken gebildet, Intramolekular und intermolekular

Fig. 3 aus: Dadoune, JP (1999) Expression of Mammalian Spermatozoal Nucleoproteins. Microscopy Research and Technique 61, Model für die Protamin basierende Chromatinstruktur (+ S-Brücken)

Übergang Histone - Protamine beim Säuger nicht direkt sondern zunächst sogenannte Transitionsproteine = TP SCHEMA an die Tafel

Aus Campbell S Testes: Säuger Wann werden Transitionsproteine, Protamine synthetisiert?

Wann? einige Abkürzungen: sg: Spermatogonien scy: Spermatocyten rspd: runde Spermatiden espd: elongierte Spermatiden Ermittelt mit: Nachweis der mRNA durch in situ Hybridisierungen Nachweis der Proteine durch Immunhistologie

Fig.2 Aus: Steger, Klaus (1999) Transcriptional and translational regulation of gene expression in haploid spermatids. Anat. Embryol. 199, Transitions- proteine (TP) und Protamine in situ TP1 mRNA Prm1mRNA Protamine (PrmRNA) P2 Protein Prm1mRNA Die römischen Zahlen bedeuten Stadien der Spermatogenese Dann: Stop der gesamtenTranskription

Fig.1 aus: Steger, Klaus (1999) Transcriptional and translational regulation of gene expression in haploid spermatids. Anat. Embryol. 199, Von Nucleosomen zu Doughnuts

Histone-Transitionsproteine-Protamine In der Spermahistogenese werden Histone gegen Protamine ausgetauscht. Bei den Säugertieren erfolgt der Austausch nicht direkt sondern mit der Zwischeneinlagerung von Transition(Übergangs-) proteinen Es gibt bei den Mäusen 2 Typen von Transitionproteinen, die von Tnp1 und Tnp2 codiert werden. Danach werden Protamine 1 und 2 synthetisiert

Ist der Wechsel de Chromatinstruktur essentiel für die männliche Fertilität??

Transitionsproteine Knock out Mäuse: funktionelle Redundanz zwischen TP1 und TP2 Was sind knock out Mäuse?: gezielte Mutation eines Gens (meist durch Insertion eines Resistenzgenes und damit Inaktivierung) durch homologe Rekombination, sogenannte reverse Genetik

Kreuzungen (vgl Mendelregeln) Man erhält heterozygote K.Os, für TP k.o. sind diese lebensfähig! Also homozygot machen! (Tafel!)

Transitionsproteine Knock out Mäuse: -TP1: fertil -TP2: fertil -TP1 und -TP2: steril ALSO: funktionelle Redundanz zwischen TP1 und TP2

Fig. 7 aus: Dadoune, JP (1999) Expression of Mammalian Spermatozoal Nucleoproteins. Microscopy Research and Technique 61, Genregulation des Protamine 2 Gens der Maus HRE: Steroid hormone responsive element CRE: cAMP responsive element

Protamine „knock out“ Maus: 2 Protamine Gene, bereits die Haploinsuffizienz für eines der beiden hat männliche Sterilität zur Folge d.h.: heterozygote Mäuse mit einem Wildtyp Allel und einem Funktionsverlust Allel von Protaminen sind männlich steril!! Mensch: verringerte Protamine Menge korreliert zu Fertilitätsstörungen

Rolle der Protamine??? Mögliche Konsequenzen des Histon-Protamin-Austausches: Viel stärkere Kondensation der DNA als in somatischen Zellen führt 1) zum Erliegen der Genexpression in Spermatiden ??? (könnte zufällige zeitliche Koinzidenz sein). 2) Generierung eines mehr hydrodynamischen Kopfes, damit sich das Spermium schneller fortbewegen kann 3) Schutz des genetischen Materials vor chemischen und physikalischen Angriffen (Mutagenen). „How to protect Daddys Genom“ 4) Reprogrammieren des väterlichens Genoms (Imprinting siehe FM nächstes Semester)

Wie sehen Spermien mit der halben Protamine Menge aus?

Varianz des Phänotyps bei veringerter Protamine Dosis Haploide Dosis an Protaminen

Färbung mit Acridine Orange weist auf unterschiedliche Chromatinkondensation. 2) Unterschiedliche Färbung mit Acridine Orange weist auf unterschiedliche Chromatinkondensation. Orange Fluoreszenz Chromatin nur teilweise verpackt. Grüne Fluoreszenz Chromatin normal verpackt.

Spermatogenesis in Drosophila melanogaster (Praktikum nächste Woche, Frau Dr. Rathke)

Jayaramaiah Raja and Renkawitz-Pohl, MCB 2005 protamine A+B and mst77F are under translational repression In situ- hybridisation on WT testis Protein- expression Bridlin Barckmann, PhD-student Philipps University, Marburg

Canoe stage 200 fold chromatin compaction Hoechst for chromatin Chromatin condensation during spermiogenesis of Drosophila

Von Histones zu Protaminen bei Drosphila (runde Spermatiden bis individualisierte Spermien)

Histone modifications, histone removal and transition proteins and... histone removal and protamine deposition are independent Protamine A Protamine B Mst77F many histone modifications transition protein Tpl 94D DNA breaks HistoneProtamine H4 acetylation CTCF

Analyse des Wechsels von Histonen nach Protaminen in Drosophila Nutzung der genetischen und experimentellen Möglichkeiten von Drosophila

Thank you for your attention

Zusätzliches Material

Hypothese: Die Reduktion der Protaminmenge bewirkt biochemische Veränderungen. Protamin-1 wird als reifes Protein, das aus 50 AS besteht, synthetisiert. Protamin-2 dagegen reift aus einem Vorläuferprotein aus 106 AS zu dem reifen Protein aus 63 AS heran (Prozessierung ) Ergebnis: Protamin1 benötigt normale Menge an Protamin2,um mit der SpermienDNA normal interagieren zu können. Man hat bewiesen, dass für die Produktion normaler Spermien Normallevel an beiden Proteinen benötigt wird.

Protamine knock out Maus: 2 Protamine Gene, bereits die Haploinsuffizienz für eines der beiden hat männliche Sterilität zur Folge Also essentiell, aber warum?? Hypothesen: Hydrodynamisch und Schutz vor Mutagenen

Haploinsuffizienz Bezeichnet ein diploides Gen, das im haploiden Zustand nicht den normalen Phänotyp bewirken kann Ist nur in den diploiden Zellen bekannt Protamine werden jedoch in den haploiden Zellen expremiert,so müßte die Mutation eines einzelnen Allels keine Auswirkung auf die Zellen mit dem intakten Allel haben, also genau auf die Hälfte der Spermien. Doch dies ist nicht der Fall. Erklärung: Cytokinese ist inkomplett Ausbildung der Cytoplasma Brücken freie Verteilung von mRNA und Proteinprodukten phänotypisch diploide Zellen

Fig.s: Steger, Klaus (1999) Transcriptional and translational regulation of gene expression in haploid spermatids. Anat. Embryol. 199, Transkriptionskontrolle des CRE- Box bindenden Proteins - - +