Hauptseminar Biophysik der Systeme

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1 Hauptseminar Biophysik der Systeme
Crime Scene ? DNA Hauptseminar Biophysik der Systeme

2 Konvektive Polymerase Kettenreaktion
Martina Bucher Sebastian Karpf Hauptseminar Biophysik der Systeme

3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Englisch: Polymerase Chain Reaction Millionenfache Vervielfältigung von DNA Erzwungene, kontrollierte Replikation DNA-Polymerase „produziert“ Kopien In vitro PCR Hauptseminar Biophysik der Systeme

4 Hauptseminar Biophysik der Systeme
Gliederung Grundbausteine der PCR Theoretische Grundlagen Schritte des PCR-Prozesses Was ist Konvektion? Bedingungen für Konvektion Aufbauten Anwendungsgebiete Zusammenfassung Hauptseminar Biophysik der Systeme

5 Grundbausteine der PCR
DNA Primer DNA-Polymerase Pufferlösung dNTP-Mix Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

6 DNA – Träger der Erbinformation
Doppelhelix 4 heterozyklische Nukleobasen Purine: Adenin und Guanin Pyrimidine: Thymin und Cytosin Desoxyribose Phosphatreste Wasserstoffbrückenbindungen Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

7 Hauptseminar Biophysik der Systeme
Primer Einsträngig Keine Wiederholung von Motiven Länge: Nukleotide GC-Gehalt: 40-60% cfrei/cgebunden = e(-G(T)/kT) G(T) = H-TS Schmelztemperatur Tm: G(T) = 0 Tm = 2°C•(A+T)+4°C•(C+G) (Näherung) Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum, Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

8 Hauptseminar Biophysik der Systeme
DNA-Polymerase Allgemein: Enzyme für Polymerisation von Nukleotiden Mit und ohne Korrektur-Funktion Für PCR meistens Tag-Polymerase (Bakterium Thermus aquaticus) Außerordentlich hitzebeständig Hauptseminar Biophysik der Systeme

9 Pufferlösung und dNTP-Mix
Volumenregulation Chemische Umgebung: PH-Wert Ionenkonzentration: Mg2+-Ionen für DNA-Polymerase dNTP-Mix: Bausteine für DNA-Strang Hauptseminar Biophysik der Systeme

10 Theoretische Grundlagen
cTemplate << cPrimer Anstieg der Zahl der Kopien exponentiell Zahl der Duplikate dominant Zahl der Kopien nach n PCR-Zyklen: N = (2n-2n) • N0 mit 2n: Zahl der Produkte des 1. und 2. Zyklusses Quelle: F-Praktikum Hauptseminar Biophysik der Systeme

11 Schritte des PCR-Prozesses
Denaturierung Primerhybridisierung Elongation Ende des 1.Zyklus Hauptseminar Biophysik der Systeme

12 Schritte des PCR-Prozesses
Denaturierung (94-96°C): Schmelzen der DNA Primerhybridisierung (Tm-5°C): Andocken der Primer an das komplementäre DNA-Stück Elongation (72°C): Verlängerung Ende des 1.Zyklus Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum Hauptseminar Biophysik der Systeme

13 Hauptseminar Biophysik der Systeme
2. Teil: Konvektive PCR Hauptseminar Biophysik der Systeme

14 Hauptseminar Biophysik der Systeme
Was ist Konvektion? Konvektion (lat. Convehere = mittragen) = Fließen von Teilchen bzw. Flüssigkeiten aufgrund von Temperaturgradienten Hauptseminar Biophysik der Systeme

15 Hauptseminar Biophysik der Systeme
PCR durch Konvektion Für die Polymerase Kettenreaktion werden zyklisch-periodische Temperaturstufen benötigt  Konvektion schafft diese Zyklen! Hauptseminar Biophysik der Systeme

16 Konvektive PCR versus Herkömmliche PCR
Vorteile: Schnelle Amplifikation Nur 2 Temperaturen nötig Nicht so träge, da keine großen Heizelemente benötigt werden Hauptseminar Biophysik der Systeme

17 Konvektionsbedingungen I
Wichtige Eckpunkte für Konvektion: Fließgeschwindigkeit v Fließlänge L Viskosität  Reynolds Nummer Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

18 Konvektionsbedingungen II
Für Konvektion muss die Reynoldszahl unter 1000 liegen Dies bedeutet: Kleines v, Kleines L Großes  Zur Erinnerung: Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

19 Konvektionsbedingungen III
Größe der Reaktionskammern müssen zwischen 100 m und einigen cm liegen Darunter: Diffusionsprobleme Darüber: nicht-laminarer Fluß D.h. Konvektion kann über bis zu 6 Größenordnungen durchgeführt werden (L3  106) Bei gutem Verlauf Verdoppelung der DNA nach jedem Zyklus (=Zyklusperiode) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

20 Hauptseminar Biophysik der Systeme
Aufbauten Drei Beispiele für Konvektionskammern: Kreisrohr (circular pipe) Rayleigh-Bénard-Zelle Zylinderzelle (cylindrical chamber) zu c) zu a) zu b) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

21 a) Kreisrohr (circular pipe)
Vorteile: gesamtes Volumen zirkuliert niedriger Energieverbrauch (Batteriebetrieb möglich) Nachteile: Parabolisches Fließprofil  stark unterschiedliche Perioden der Amplifikationszyklen Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

22 b) Rayleigh-Bénard-Zelle
Konvektionskammer zwischen 2 geheizten Platten. Es bilden sich Konvektions-Zirkulationen. Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

23 b) Rayleigh-Bénard-Zelle
ΔT < ΔTkrit,1 : Viskosität überwiegt Konvektionsströmung ΔTkrit,1 < ΔT < ΔTkrit,2 : Es treten regelmäßig geformten Konvektionszellen auf, die Bénard-Zellen ΔTkrit,2< ΔT : Das System gelangt ins Chaos Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

24 b) Rayleigh-Bénard-Zelle
Vorteile: einfacher-kompakter Aufbau Nachteile: Viel Energie für Heizplatten benötigt Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

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c) Zylinderzelle Erklärung anhand der Versuchsaufbauten gefunden in: (1) „Exponential DNA Replication by Laminar Convection“ Von Dieter Braun et al., 2003 (2) „PCR by Thermal Convection“ von Dieter Braun Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

26 Arbeit von Dieter Braun
Infrarotlicht (1480 nm) im Zentrum des 1mm x 5mm großen Zylinders Umgebungstemperatur 52°C Errechnete Reynoldsnummer für: laminaren Fluss Länge L  2mm Viskosität von Wasser   1mm2/s typische Geschw. v  0,4mm/s ergibt Re  1 Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

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Ergebnisse Bereits nach 25 Minuten ergab sich fache Amplifikation DNA ließ sich durch Fluoreszenzmarker visualisieren Gewünschte DNA-Amplifikation über Gelelektrophorese überprüft und bestätigt Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

28 Visualisierung der DNA
Interkalierende Fluoreszenzmarker binden nur an doppelsträngige DNA Man erkennt die Amplifikation der DNA Dunkle Stellen deuten auf Einzelstränge hin Nach Auschalten des IR-Lichtes verschwand der schwarze Punkt im Zentrum Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

29 Visualisierung der DNA
Quelle: Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

30 Analyse durch Gelelektrophorese
Vergleich mit DNA bekannter Länge bestätigt, dass 100bp DNA-Sequenzen amplifiziert wurden. Die Probe nach 0 min zeigt keine 100bp Sequenzen. Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

31 Temperaturabhängigkeit
der PCR wurde durch kontinuierliche Leistungsänderungen der Infrarotquelle bestimmt. (bei bestimmter Bahn z0=50m) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

32 Video der zylindrischen konvektiven PCR
Quelle: Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

33 Hauptseminar Biophysik der Systeme
c) Zylinderzelle Vorteile: Sehr schnell (25 min für fache Amplifikation) Hohe Effizienz (50%), da gutes Strömungsverhalten Geringe Energie benötigt (Batteriebetrieb möglich) Nur optisch, keine Heizkontakte nötig Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

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Anwendungsgebiete Genetischer Fingerabdruck Vaterschaftstest Erkennung von Krankheiten Klonierung von Genen Mutagenese Analyse alter (fossiler) DANN Geschlechtsbestimmung Pränataldiagnostik Hauptseminar Biophysik der Systeme

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Zusammenfassung PCR vermehrt exponentiell eine gewünschte DNA-Sequenz, wobei nur kurze Sequenzen amplifiziert werden können Konvektive PCR ist high-speed PCR Einfache Designs Kostengünstige Möglichkeit Sehr kleine Versuchsaufbauten möglich Hauptseminar Biophysik der Systeme