Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie

Präsentation zum Thema: "Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie"—  Präsentation transkript:

1 Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie
Blockpraktikum Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 2004/2005 Bianca Löhr

2 Übersicht Einführung Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Möglichkeiten der Überexpression Expressionssysteme in E.coli Affinitätschromatographie

3 Einführung In der Molekularbiologie werden oft größere Mengen an nativem Protein benötigt Analyse der Funktion, Struktur etc. Überexpression bedeutet erhöhte Expressions- bzw. Transkriptionsrate eines Gens Auch verwendet für: vermehrte Bildung eines bestimmten Proteins über die natürliche Konzentration hinaus

4 Einführung Homologe Genexpression  Expression im endogenen Wirt
Heterologe Genexpression  Expression in fremden Wirtssystemen

5 Einführung Natürlich auftretende Überexpression als Antwort auf unterschiedliche Milieubedingungen Nahrung, Temperatur etc. Immer induzierbare Expressionssysteme Künstliche Überexpression Nutzung von regulierbaren Promotoren aber auch von konstitutiven Systemen Es existieren viele Expressionssysteme für z.B. Bakterien, Pilze, Hefen, Höhere Pflanzen und Tiere

6 Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Bei der Überexpression können Probleme auftreten die durch das jeweilige Protein bedingt sind Proteine wirken teilweise toxisch Proteine werden abgebaut  Proteolyse Es treten niedrige Expressionsraten, Lyse und Absterben der Zellen auf Verminderung dieser Auswirkungen durch: Niedrige Kultivierungstemperaturen, kurze Induktionszeiten Einsatz proteasedefizienter Wirtsstämme Veränderungen des N-Terminus

7 Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Codonverteilung: Die Codonverteilung in unterschiedlichen Organismen ist verschieden Die Bevorzugung best. Triplettkombinationen führt zu unterschiedlichen Konzentrationen der zugehörigen tRNAs Die Translation eines fremden Gens mit anderen Codons ist erschwert Anpassung der Codons an die des Wirtes durch Mutagenese Co-Überexpression bestimmter tRNAs

8 Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Posttranslationale Modifizierung eykaryontischer Proteine  Glycosilierung, Phosphorylierung, etc. Modifizierung ist im Wirtssystem verändert oder fehlt Nutzung von möglichst nah verwandten Expressionssystemen

9 Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Bildung von Disulfidbrücken Bei Prokaryonten extracellulär bzw. im Periplasma Bei Eukaryonten im ER, nicht im reduzierenden Cytoplasma Eukaryontische Gene aggregieren bei cytosolischer Expression Transport in ein oxidierendes Zellkompartiment muss gewährleistet sein

10 Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Aggregation und Bildung von Inclusion Bodies bei Überexpression von hydrophoben Proteinen Proteine liegen nicht mehr in nativer Form vor Verminderung durch:  Limitierte Induktion, niedrige Temperatur, Gabe von nicht-metabolisierbaren Glucose-Homologon, Fusionsprotein, Überexpression von Hitzeschock-Proteinen

11 Möglichkeiten der Überexpression
Überexpression als Inclusion-Body-Protein Nur bei guter Renaturierung des Proteins Vorteile: hohe Konzentrationen möglich (bis 50% des Gesamtzellproteins) und einfache Aufreinigung

12 Möglichkeiten der Überexpression
Überexpression als Fusionsprotein Fusion mit Proteinen bzw. Proteindomänen Fusion mit kurzen, endständigen Peptiden: tags Vorteile: Verringerung von Toxizität, Proteolyse, Aggregation, Effiziente Aufreinigung mit Affinitätschromatographie

13 Möglichkeiten der Überexpression
Häufig verwendete Fusionspartner-Proteine und Tags

14 Möglichkeiten der Überexpression
Reinigungsschema für GST-Fusion

15 Möglichkeiten der Überexpression
Spaltung der Fusionspartner Chemisch: Hydrolyse der Peptidbindung Enzymatisch: z.B. durch den Xa-Faktor

16 Expressionssysteme in E.coli
Eine hohe konstitutive Expression beeinträchtigt meist den Zellmetabolismus Daher Anwendung von induzierbaren Expressionssystemen Promotor-Operator-System Induktion durch Metabolitzugabe, Entfernen best. Kohlenstoffquellen, Temperaturveränderungen

17 Expressionssysteme in E.coli
Häufig genutzte Promotoren in E.coli

18 Affinitätschromatographie
Prinzip: Spezifische und reversible Adsorption eines Moleküls an einen individuellen, matrixgebundenen Bindungspartner Selektive Adsorption aus einer komplexen Mischung

19 Affinitätschromatographie
Schema Affinitätschromatographie

20 Affinitätschromatographie
Durchführung: Adsorption der Probe: Bindungskonstante des Proteins  von 10-5 bis 10-7 M Waschen: Entfernung unspezifisch gebundener Komponenten durch erhöhte Ionenstärke Desorption: spezifisch oder unspezifisch Regeneration der Matrix: richtet sich nach der Verunreinigung der Ausgangsprobe

21 Affinitätschromatographie
Schema Matrix

22 Affinitätschromatographie
IMAC = immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie Basiert nicht auf biospezifischen Erkennungsmechanismen

23 Affinitätschromatographie
Prinzip: Metall-chelatierte Gruppe ( bei uns NTA) ist am Säulenmaterial immobilisiert Ein multivalentes Übergangsmetall-Ion (bei uns Nickel) bindet an das NTA Interaktion mit den Histidinresten des His-tags Desorption durch Gradientenelution mittels Imidiazol  kompetetive Verdrängung

24 Affinitätschromatographie
Bindung von zwei Histidinresten an die Ni-NTA-Gruppe