Timing, self-control and a sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability David Summers Department of Genetics, Downing Street, Cambridge,

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1 Timing, self-control and a sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability
David Summers Department of Genetics, Downing Street, Cambridge, UK

2 Ausgangssituation Fragen: Bekannt ist:
multicopy plasmide werden bei der Zellteilung zufällig auf die Tochterzellen übertragen natürliche Plasmide sind extrem stabil hinsichtlich ihrer Kopienzahl künstliche Vektoren (pUC-Reihe) gehen unter nicht-selektiven Bedingungen schnell verloren multicopy-plasmide können durch Rekombination leicht multimerisieren wie wird die Kopienzahl reguliert? wie werden Multimere aufgelöst?

3 Modelle zur Kontrolle der Kopienzahl
Sufenmodell: hohe Replikationsrate bis zum Sollwert, dann kompletter Stop Exponentielle Kinetik: Mittelwert Hyperbolische Kinetik: umgekehrte Proportionalität zw.Kopienzahl und Replikationsrate

4 Replikationskontrolle des Plasmids ColE1
RNAII Präprimertranskript wird transkribiert hybridisiert am OriV Spaltung durch RNAse H Spaltprodukt bildet Replikationsprimer Replikation startet

5 Replikationskontrolle des Plasmids ColE1
RNAI-Repressortranskript interagiert mit RNAII Veränderte Faltung der RNA keine Primerbildung, keine Transkription

6 Folgen der Plasmid-Multimerisierung
Bereits kleiner Anteil an Dimeren wirkt sich aus Chance, dass plasmidfreie Zellen entstehen Dimer hat doppelte Chance, repliziert zu werden Dimere verdrängen Monomere Dimer Katastrophe Aber: Zellen mit Multimeren wachsen langsamer

7 Auflösung von Plamid-Multimeren
Replikationsstellen auf Plasmiden: cer-site aus 240 Bp Bindestelle für XerC- und XerD-Rekobinase Weitere Proteine: ArgR und PepA Rekombination an cer folgt topologischem Zwang XerCD könnte in cis und in trans rekombinieren Topologischer Zwang muss von anderen Proteinen stammen

8 ArgR bildet in Gegenwart von Arginin eine Hexamer
enthält DNA-Bindedomäne bindet an ARG-Boxen (z.B. cer-site) biegt DNA um 70-90° Mutation von ArgR senkt Zwang zum cis-Produkt

9 Zustand im Plasmid-Monomer:
ArgR, XerCD und PepA bilden Komplex an cer-site ArgR kann als „Dimer von Trimeren“ angesehen werden Ein Trimer kann die cer-site binden

10 Zustand im Plasmid-Dimer
2 single-site Komplexe assoziieren Synaptischer Komplex ArgR bildet Brücke

11 Zustand im Plasmid-Dimer
Arg alleine ist zu schwach um den Komplex zu stabilisieren Stabilisierung durch Anlagerung von Supercoil-DNA Stabilisierung kann nur in cis funktionieren Topologisch einzigartiges Rekombinationsprodukt

12 Verbindung zwischen Rekombination und Zellteilung
Promotor Pcer an der cer-site Genprodukt (Rcd) inhibiert Wachstum der Zellen Stopp des Zell-Zyklus c(Rcd) ist in Zellen mit Multimeren erhöht Synaptische Komplexe verändern DNA-Struktur und ermöglichen Transkription von Pcer Rcd bildet eine Checkpoint bei der Replikation

13 Der Rcd-Checkpoint Bei Zellteilung mit unvollständiger Multimerauflösung besteht die Gefahr plasmidloser Tochterzellen Problem: langsamer Rekombinationsmechanismus Erster Strangaustausch wird von XerC katalysiert Bildung der Holiday-junction Kein XerD-katalysierter Austausch den Gegenstrangs Komplex muss disoziieren, Auflösung der Holiday-junction erfolgt durch zelleigene Resolvase Verlangsamung des Gesamtvorgangs Erhöhung der Chance von Multimeren

14 Zusammenfassung Plasmid-Multimere stellen die Zelle vor Probleme
Xer-cer Rekombination löst Multimere auf Langsamer Vorgang Rcd-Checkpoint sichert Replikation ab