Kevin L. Briggman and Wiliam B. Kristan Jr

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1 Kevin L. Briggman and Wiliam B. Kristan Jr
Imaging Dedicated and Multifunctional Neural Circuits Generating District Behavior Kevin L. Briggman and Wiliam B. Kristan Jr

2 Zentrale Muster Generatoren (Central Pattern Generator (CPG)):
Kern der Erzeugung vieler rhythmischer Verhalten im Nervensystem CPGs bringen Motorneurone dazu, Muskeln zielgerichtet zu aktivieren gleiche Muskeln für unterschiedliche Verhalten zwei Modelle, wie CPGs organisiert sind: 1. Reservierte Kreisläufe (dedicated circuitry) - anatomisch verschiedene Neuronenpopulationen ausschließlich für das Erzeugen eines Verhaltens zuständig - bei Heuschrecken beobachtet worden (zwei unterschiedliche Neuronenpopulationen, die das Laufen und das Fliegen kontrollieren und in den selben Muskeln zusammenlaufen) 2. Vielseitige Kreisläufe (multifunctional circuitry) - stellen einen gewissen Grad der Überschneidung von mehreren CPGs dar - häufige Eigenschaft von vielen Invertebraten - Nervensystemen - im Extremfall kann dadurch ein einzelnes Netzwerk, durch neuronale Anpassung, so umgeschaltet werden, dass es mehrere Rhythmen erzeugt

3 Methoden: Präparat: Hirudo medicinalis ( der europäische medizinische Blutegel) ganzer Nervenstrang herauspräpariert (mit head- und tailbrain & allen 21 Ganglien) betrachtet wurde Ganglion 10 (G10) Retzius-Zellen und Bindegewebe wurde entfernt für Extrazellulärableitungen und Stimmulation: zwei dorsale posterior (DP) Nerven, zwischen G12 und G15 „Schwimmen“ auslösen: DP(12) und DP(13) mit 10 ms langen Pulsen von 15 Hz und 2-3mV stimulieren „Kriechen „ auslösen: einzelne tailbrain Nerven mit den gleichen Pulsen stimulieren

4 FRET = fluorescence resonance energy transfer
auf FRET- basierende spannungs-empfindliche Farbe (voltage-sensitive-dye (VSD) benutzt Experimente alle überwacht durch intrazelluläre Ableitung von zwei Zellen: - Ableitungen der dorsalen Oberfläche: Zelle 1 und Zelle 3 - Ableitungen von der ventralen Oberfläche: Zelle CV und Zelle AE als Referenz für die optische Ableitung der Zellen wurden die optischen Signale von Zelle 3 (dorsale Seite, Schwimmen, Kriechen), von Zelle AE (ventrale Seite, Kriechen) und Zelle 208 (ventrale Seite, Schwimmen) herangezogen

5 untersucht wurden das Schwimmen und das Kriechen eines Blutegels
Längs- und Ringmuskulatur, in grundlegend unterschiedlichen Weisen koordiniert, um die zwei Formen der Fortbewegung auszuführen Wichtig: Ein Blutegel kann nicht gleichzeitig Schwimmen und Kriechen!!! jeder der zwei Fortbewegungsvarianten liegt ein CPG zu Grunde Bestehen die zwei CPGs aus getrennten oder sich überschneidenden Neuronenpools?

6 Das Schwimmen: abwechselnde dorsale und ventrale Kontraktionen der Längsmuskulatur pflanzen sich über die Länge des Tieres fort dorsoventrale Muskulatur verstärkt aktiv, um dem Tier beim Abflachen zu helfen hauptsächlich hemmende CPG Interneurone sind für die Steuerung der periodischen Kontraktionen verantwortlich Das Kriechen: Kontraktion der Ringmuskulatur bewirkt Ausdehnung des Körpers Co-Kontraktion der dorsalen und ventralen Längsmuskulatur bewirkt Verkürzung des Körpers Elongation und Kontraktion der Muskeln pflanzen sich der Länge des Egels nach fort Das Nervensystem kann sehr schnell zwischen Schwimmen und Kriechen hin- und herschalten ( innerhalb von 1-2 Sekunden)

7 Zusammenhängende Oszillationen der Neurone beim Schwimmen und Kriechen an der dorsalen Seite
zur Beobachtung der Überlappung der CPGs der beiden Verhaltensweisen, wurden alle Neurone in einem Ganglion eines Segments während der zwei laufenden motorischen Rhythmen dargestellt intakter Nervenstrang isoliert; dorsale/ventrale Oberfläche von Ganglion 10 für VSD - Ableitung Motorneuronenmuster für beide Verhalten als motorische Reize in DP-Nerven von Segment 12 und 13 abgeleitet (extrazelluläre Ableitung) dorsale Seite von G10 Extrazellulärableitung beim Kriechen Extrazellulärableitung beim Schwimmen

8 gleichzeitig intrazellulär von zwei Motorneuronen, Zelle 1 und Zelle 3, abgeleitet, um die optische Ableitung abzugleichen Zelle 3 erregt dorsale Längsmuskulatur Zelle 1 hemmt dorsale Längsmuskulatur Intrazellulär (schwarz) & optisch (rot) beim Schwimmen Intrazellulär (schwarz) & optisch (rot) beim Kriechen

9 Phasendiagramme Schwimmen Kriechen

10 Zusammenhängende Oszillationen der Neurone beim Schwimmen und Kriechen an der ventralen Seite
ähnliche Experimente wie bei der dorsalen Oberfläche von G10 Extrazellulärableitung von DP-Nerven in Segment 12 und 13 ventrale Seite von G10 Extrazellulärableitung beim Kriechen Extrazellulärableitung beim Schwimmen

11 Motorneuronen (Zelle CV und Zelle AE)
optische Ableitung und gleichzeitig Intrazellulärableitung von zwei Motorneuronen (Zelle CV und Zelle AE) intrazelluläre (schwarz) & optische (rot) Ableitung beim Schwimmen intrazelluläre (schwarz) & optisch (rot) Ableitung beim Kriechen CV regt Ringmuskulatur an und ist in der Dehnungsphase des Kriechens aktiv AE ist in der´Kontraktionsphase depolarisiert

12 Phasendiagramme Kriechen Schwimmen

13 Zusammenfassung der dorsalen und ventralen Phasenkarten
Eine Zelle wurde in das zusammengefasste Phasendiagramm aufgenommen, wenn: 1. während Schwimmen und/oder Kriechen immer die gleiche Phase 2. immer etwa der gleiche Durchmesser und etwa die gleiche Position im Gliapaket Dies musste in 4 von 8 (dorsalen) bzw. 6 (ventralen) Untersuchungen der Fall sein

14 Zusammenfassende Phasenkarten für Kriechen und Schwimmen
dorsal ventral

15 Die Netzwerke für das Schwimmen und das Kriechen überschneiden sich
Bestimmung des Übrlappungsgrades: Wie viele Neuronen waren in jeder Phase jedes Verhaltens aktiv? fast gleiche Anzahl an Zellen in jeder der Schwimmphasen stimmt mit der bekannten Phasen Streuung von bekannten Neuronen im Schwimm-CPG („Schwimmmustergenerator“) überein bei der Elongation des Kriechen sind doppelt so viele Neurone aktiv als bei der Kontraktion mehr als doppelt so viele aktive Neurone beim Kriechen (188) im Vergleich zum Schwimmen (90) Kriechen Schwimmen

16 Um herauszufinden, ob bestimmte Phasen
Überlagerung der Neuronenaktivität während der beiden Verhaltensweisen ist sehr hoch: - 93% der Zellen, die beim Schwimmen oszillieren, sind auch beim Kriechen aktiv Um herauszufinden, ob bestimmte Phasen eines Verhaltens vorhersehbar sind hat man eine Kontingenztabelle angelegt

17 Beispiel für zwei Phasen-Kombnationen im Übergang vom Kriechen zum Schwimmen:
Zellen 3 und 4 oszillieren während des Kriechens phasengleich und beim Schwimmen sind sie um 180° phasen-verschoben

18 Bestimmung von Neuronen mittels der zusammengefassten Phasenkarte
vorher unbekannte Neurone werden identifiziert (durch VSD) Zelle 255: - depolarisiert und spikt in Elongationsphase des Kriechens (phasengleich mit CV) - hyperpolarisiert während der Kontraktionsphase des Kriechen - beim Schwimmen gleichzeitig aktiv mit Zelle 208 - in 15 Präparationen elektrophysiologisch identifiziert - 14 von 15 Mal mit fluoreszierender Farbe gefüllt Morphologie - immer nur ein so ein Neuron pro Ganglion gefunden

19 Phasengleiche Oszillation der Zelle 255 in zwei Verhalten, weißt auf Mitwirkung des Neurons in zwei CPGs hin. Prüfen der Hypothese: de - und hyperpolarisierender Stom (2-5s) in Zelle 255 bei laufenden Verhalten depolarisierender Strom: - während Kontraktion Abbruch der Kontraktion und früheres Einsetzten der Dehnung - während der Elongation kein Effekt aufs Kriechen der depolarisierende Strom kann also das Kriechen beschleunigen dieses Neuron depolarisiert nicht nur bei der Dehnung, sondern ist auch an der Erzeugung der Elongation im „Kriech- CPG“ beteiligt

20 depolarisierender Strom während des Schwimmens:
Abbruch des Schwimmabschnitts oder Verlangsamung einer Schwimmperiode für die Dauer des Reizes hyperpolarisierender Strom keinen bleibenden Einfluss auf keinen Rhythmus Zelle 255 ist ein multifunktionales Neuron, es oszilliert mit beidenVerhaltensweisen Zelle 257: - Membranpotential oszilliert beim Kriechen, nicht beim Schwimmen - wie Zelle 255 spikt sie in Elongationsphase des Kriechens - beim Schwimmen ist die Zelle stark hyperpolarisiert diese Zelle ist eine reservierte, nur für ein Verhalten bestimmte Zelle, da sie nur beim Kriechen aktiv ist und beim Schwimmen hyperpolarysiert

21 Fazit: mit diesen Phasenkarten(-diagrammen) kann man:
Dynamik in Kreisläufen besser darstellen einzelne Bestandteile der Kreisläufe besser identifizieren [z.B. Zelle 255(multifunktional)] Informationen über Überschneidung zweier CPGs erhalten multifunktionale Neurone oder z.B. speziell die individuellen Neurone, die das Kriechen bedingen, untersuchen

22 Im Falle des „Kriech - CPG“ weiß man nun, dass beim Kriechen mehr
Neurone aktiv sind im Vergleich zum Schwimmen „Kriech – CPG“ stärker verteilt als das „Schwimm- CPG“ Eine Interpretation: „Schwimm - CPG“ überlagert „Kriech – CPG“ - alle Spezien des Blutegels können Kriechen - nur etwa die Hälft der Spezien können Schwimmen Kriechen evolutionär einfacher Schwimmen durch Mitbenutzung des bereits bestehenden Kreislaufs entwickelt die starke Überlappung der Neurone der Schwimm- und Kriechpopulationen lässt vermuten, dass sie Teil eines dynamischen Systems sind, dass in zwei Systemen, in unterschiedlichen Zeitskalen, arbeiten kann.