Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion

Präsentation zum Thema: "Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion"—  Präsentation transkript:

1 Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion
trFTIR Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion

2 Nutzung von trFTIR in der Bioanalytik
NMR und XRD: Struktur eines Proteins im Grundzustand, statisch ? trFTIR gibt Informationen über die Proteindynamik auf atomarer Ebene in μs bis ns Zeitauflösung unter physio-logischen Bedingungen! Informationen: - Ladungsverteilung - H-Brücken - Protonierungszustände - Kinetik

3  Identifizierung und Beobachtung von reaktiven Gruppen
Differenzspektren  Identifizierung und Beobachtung von reaktiven Gruppen

4 Apparatur  Hohe Anforderungen, da Hintergrundintensität viel stärker ist, als die Intensitätsänderungen (3-5 Größenordnungen) Michelson Interferometer (Multiplexvorteil) Gleiche Bedingungen bei jeder Messung! Wiederholungsmessungen zur Verbessung des Signal/Rausch Verhältnisses (~ )

5 Apparatur Michelson Interferometer L  M  Z  D

6 Reaktionsinitiierung
Zeitauflösung Reaktionsinitiierung a) Direkt über ns - Laserblitz  nur bei photobiologisch aktiven Proteinen z.B. Bacteriorhodopsin b) Photolabile Trigger-Substanzen z.B. Caged ATP c) Mischzellen  max. µs - Auflösung

7 Zeitauflösung Rapid Scan
Spektrenaufnahme mit schneller Spiegelbewegung  schnelle aufeinanderfolgende Aufnahme vollständiger Interferogramme - It(x) ms - Auflösung auf alle Reaktionen anwendbar Step Scan Bei fixierter Spiegelposition wird Zeitabhängigkeit des Signals gemessen - Ix(t). Wiederholung der Messung bei jeder Spiegelposition ns - Auflösung (Detektionsbegrenzung) nur zyklische Reaktionen (z.B. Bacteriorhodopsin), andernfalls besondere Technik notwendig

8 Zeitauflösung Step Scan Technik
Häufige Reaktionswiederholung (oft > 1000x)  genau gleiche Bedingungen! Techniken für azyklische Reaktionen: Flow cells  Austausch der Substanz hoher Substanzbedarf kleine Extinktionsänderungen nicht messbar (grosse Zelldimensionen) Fokussierung des Laser/IR Strahls  Messung von einzelnen Probensegmenten μm Film zwischen CaF2-Fenstern (Filmdicke ± 10%) Aufheizung der Probe Beeinflussung von Segmenten durch Streulicht

9 Austausch von Aminosäuren
Bandenzuordnung Austausch von Aminosäuren  Eine bestimmte Extinktions-änderung entfällt (neue Aminosäure ist unreaktiv) Problem: invasive Mutation Isotopenmarkierung Verschiebung der Wellenzahl der Extinktionsänderung (Isotopeneffekt)

10 Beispiel für ein Step Scan trFTIR Gerät
Kommerzielles FTIR Spektrometer mit Globar, Beamsplitter, Spiegel Farbstofflaser (Laserblitz ca. 20 ns) Individuelle Anfertigung von Messzelle und Signalverstärker Kommerzieller stickstoffgekühlter MCT-Detektor (Mercury/Cadmium/Tellur) mit einer Zeitauflösung von ca. 20 ns Schnelle Photodiode, die durch Laserreflex aktiviert wird und Aufnahme der Daten auslöst 3 mbar Vakuum im Geräteraum, um Vibration des Spiegels durch Geräusche zu minimieren Isolationstisch und Temperaturkontrolle

11 Zusammenfassung und Ausblick
Vorteile der trFTIR - physiologische Bedingungen - Informationen über H-Atome und Ladungsverteilungen - Instabile Intermediate sind messbar - Kinetische Informationen Nachteil Noch keine Standardprozedur zur Vermessung verschiedener Proben verfügbar. Aufwändige, auf das Problem zugeschnittene, technische Modifikationen Ausblick - Standardisierung und Validation der Methoden - fs - Zeitauflösung - Theoretische Berechnung kompletter IR-Spektren und Vergleich mit dem Experiment  Struktur und Ladungsverteilung im Reaktionsverlauf!

12 Fehlfunktion von Proteinen Auslöser vieler Krankheiten
Anwendung Fehlfunktion von Proteinen Auslöser vieler Krankheiten Untersuchung molekularer Reaktionsmechanismen Verständnis Struktur, Funktion und Interaktion von Proteinen Voraussetzung Entwicklung gezielter wirkender pharmakologische Substanzen mit weniger Nebenwirkungen

13 Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin
Aufklärung katalytische Schritte Mechanismus stimmt mit 10 Jahre später über Röntgenstrukturanalyse ermittelter Kristallstruktur überein Bakteriorhodopsin [2]

14 Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin
Retinal über Schiffsche Base Gebunden Wird durch Licht angeregt Isomerisierung (pk-Änderung) H-Brücke W402 aufgespalten Freie OH-Gruppe W401 kann negative Ladung des Asp 85 nicht mehr stabilisieren Protonentransfer von Schiffscher Base auf Asp 85 Arg 82 bewegt sich Protonierter Wasserkomplex nahe der Oberfläche destabilisiert Gibt Proton ab Wasser aktiv beteiligt All trans zu 13 cis retinal Protonentransfer im Bakteriorhodopsin mit Hilfe von Wasser [1]

15 Wie Proteine Protonen pumpen
1190 cm-1 Deprotonierung Zentrale Protonenbindestelle 1762 cm-1 Protonierung Asp-85 Differenzspektrum Protonentransfer Bakteriorhodopsin [1]

16 Schaltmechanismus von GTPasen
RAS kontrolliert Wachstumssignal Mutationen unkontrolliertes Zellwachstum GAP hydrolysiert nicht mehr Verfolgt RAS-GTP-Hydrolyse GAP = GTPase aktivierendes Protein in 30 % aller Tumore entdeckt - Krebs Struktur vom Intermediat (H2PO42- ) [1]

17 Schaltmechanismus von GTPasen
Ras(*Ras)Gap: Intermediat (1143 cm-1) Katalyse durch positive geladene Lys, Arg und Mg2+ Mutation Arg zu ungeladenem Gln -> Verlangsamung GAP = Ras GTPase aktivierendes Protein Positive Ladung Lys, Arg und Mg2+ katalysieren reaktion -> mutation arg zu ungeladenen gln verlangsamt reaktion um faktor 4 GTP-Hydrolyse [1] Differenzspektrum GTP-Hydrolyse [2]

18 Pharmascreening Nahezu alle Moleküle IR-aktiv (keine Fluoreszenzmarkierung) Kann direkt Einfluss Pharmaka auf Protein bestimmen z.B. Reaktivierung RAS Studieren potentieller Pharmaka Identifizierung aktivierender Pharmaka Substanzen in natürlicher Umgebung studieren (RAS über Lipidanker an Membranmodelle binden die auf ATR-Oberfläche aufgetragen sind)

19 Ausblick Entwicklung verbesserter Biokatalysatoren Herstellung gezielter wirkender Pharmaka mit weniger Nebenwirkungen Untersuchung Protein mit unbekannter Raumstruktur Charakterisierung G-Proteingekoppelter Rezeptoren

20 Literatur Proteinreaktionen: aufgelöst mit trFTIR, Nachrichten aus der Chemie, 5 K. Gerwert, Ber. Bunsen-Ges. Phys. Chem., 1988, 92, 978 W. Uhrmann , A. Becker, C. Taran, F. Siebert, Appl. Spectrosc., 1991, 45, 390 R. Rammelsberg, B. Hessling, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Appl. Spectrosc., 1997, 51, 558 R. Rammelsberg, S. Boulas, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Vib. Spectrosc., 1999, 19, 143