Metabolic Engineering of Escherichia coli for Enhanced Production of Succinic Acid, Based on Genome Camparison and In Silico Gene Knockout Simulation.

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1 Metabolic Engineering of Escherichia coli for Enhanced Production of Succinic Acid, Based on Genome Camparison and In Silico Gene Knockout Simulation S. J. Lee, D.Y. Lee, T. Y. Kim, B. H. Kim, J. Lee, and S. Y. Lee Applied and Environmental Mikrobiology, 2005, Nadja Kleisch

2 Inhalt Einleitung Ergebnisse Zusammenfassung Succinylsäure Relevanz
1. Seminar Nadja Kleisch Inhalt Einleitung Succinylsäure Relevanz Produktion in E. coli Neuer Ansatzpunkt Ergebnisse Vergleich der metabolischen Stoffwechselwege In silico Vorhersage Zusätzliche Optimierungen Pyruvat Zusammenfassung

3 1. Seminar Nadja Kleisch Einleitung

4 Succinylsäure Bernsteinsäure
1. Seminar Nadja Kleisch Succinylsäure Abb.1.: Strukturformel von Bernsteinsäure[1] Bernsteinsäure farblose, kristalline, aliphatische Dicarbonsäure[2] eins der Fermentationsprodukte im anaeroben Metabolismus ebenso ein Zwischenprodukt im Citratzyklus Herstellung sowohl technisch als auch biotechnologisch

5 Gewinnung der Succinylsäure
1. Seminar Nadja Kleisch Gewinnung der Succinylsäure technisch: katalytische Hydrierung von Maleinsäure, Maleinsäurehydrids oder Fumarsäure[4] Katalysatoren z.B. Ni, Cu oder NiO biotechnologisch: durch Fermentation, aus Kohlenhydraten  C6 Zuckern[5] effiziente Bernsteinsäureproduzenten sind u.a.: das obligate anaerobe Anaerobiospirillum succinciproducens Mitglieder der Familie Pasteurellaceae: Basfia succinciproducens [7] Actinobacillus succinogenes[6] Mannheimia succinciproducens [8] Abb.2.: technische Produktion von Bernsteinsäure[1] aus Maleinsäure

6 Relevanz 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015
entwieder die Folie oder Folie 6 Abb.3.: Bernsteinsäure-produkte [13] modifiziert E363

7 Relevanz Lebensmittelindustrie technischer Bereich
1. Seminar Nadja Kleisch Relevanz [9] Lebensmittelindustrie wegen salzigem Geschmack als Zusatzstoff Nummer E363 zugelassen Verwendung in Trockensuppen, Desserts und Getränkepulvern technischer Bereich Plattformchemikalie jährlichen Bedarf von ca Tonnen Herstellung von Polyestern und Alkydharzen Weichmacher von Kunststoffen „Hoffnung“ im biotechnologischen Bereich Verwendung als Rohstoffersatz für industriell produzierte Chemikalien und Polymere könnte Ausgangstoff sein für die Produktion von: 1,4-Butandiol, Tetrahydrofuran, γ-Butyrolactam, γ-Butyrolacton verschiedenen Produkte der chemischen und pharmazeutischen Industrie biobasierte Kunststoffe wie Polyamide, Polyester, Co-Polyester, Polyesteramide

8 Relevanz Marktpotenzial von hunderttausend Tonnen prognostiziert
1. Seminar Nadja Kleisch Relevanz Marktpotenzial von hunderttausend Tonnen prognostiziert Bernsteinsäureproduktion als Forschungsschwerpunkt zwei Ansätze: Optimierung natürlicher Bernsteinsäureproduzenten wie Mannheimia succinciproducens Einsatz von gut erforschten, leicht kultivierbaren Stämmen wie E. coli

9 Produktion in E. coli: Optimierungsversuche:
1. Seminar Nadja Kleisch Produktion in E. coli: ist grundsätzlich während der anaeroben Fermentation in der Lage Bernsteinsäure zu produzieren  Metabolic Engineering Optimierungsversuche: Mutante NZN111, enthält Doppelmutation ldhA und pfl zur Reduktion von Nebenprodukten[10] geringeres Wachstum, verhindert lediglich Milchsäureproduktion Steigerung der Ausbeute durch: Vermehrung der CO2- fixierenden anaplerotischen Stoffwechselwege Amplifikation von PEP-Carboxykinase aus Actinobacillus succinogenes in einem PEP-Carboxylase negativem E. coli-Stamm [11]  trotz dieser Optimierungen kein Hochleistungsstamm Abb.4.: Metabolische Stoffwechselwege von E. coli [8] lediglich als Nebenprodukt produziert bevorzugt Essigsäure, Milchsäure, Ameisensäure und Ethanol Anaplerotische (altgriechisch ἃνά–πληρόω auffüllen, vollzählig machen) Reaktionen sind dem Citratzyklus zuliefernde Stoffwechselwege. Durch sie werden Verluste von Intermediaten des Citratzyklus, entstanden durch Abzweigung dieser Intermediate für Biosynthesen, ausgeglichen. Im Gegensatz dazu stehen cataplerotische Reaktionen. Ein Beispiel für eine anaplerotische Reaktion ist die Synthese von Oxalacetat aus Pyruvat und Kohlenstoffdioxid, katalysiert durch die Pyruvat-Carboxylase: Pyruvat + CO2 + ATP + H2O → Oxalacetat + ADP + Pi + 2 H+ PEP Carboxylase ATP + Oxaloacetate <=> ADP + Phosphoenolpyruvate + CO2 t dasjenige Enzym, das die Umwandlung von Oxalacetat mittels GTP zuPhosphoenolpyruvat katalysiert.

10 Neuer Ansatzpunkt durch:
1. Seminar Nadja Kleisch Neuer Ansatzpunkt durch: Veröffentlichung des vollständig sequenzierten Genoms von M. succiniproducens MBEL55E gram negatives, capnophiles Bakterium Hochleistungsstamm  daraus ergibt sich die Möglichkeit, metabolischen Flüsse von M succiniproducens MBEL55E in E. coli nachzuahmen  logik- und wissensbasierte Herangehensweise zur Stammoptimierung

11 1. Seminar Nadja Kleisch Ergebnisse

12 Vergleich der metabolischen Stoffwechselwege
1. Seminar Nadja Kleisch Vergleich der metabolischen Stoffwechselwege Ziel relevante Stoffwechselwege zu identifizieren und nachzuahmen komparative Analyse der zentralen Stoffwechselwege in Bezug auf die Bernsteinsäureproduktion von E. coli und M. succiniciproducens Grundlage: in E. coli führen diverse metabolische Flüsse von dem Produkt weg Genom von E. coli ca. 2 mal größer Umsetzung: Vergleich bezieht nur metabolische Stoffwechselwege mit ein, die in E. coli gefunden wurden, aber nicht in M. succiniciproducens

13 Zielgene für knockout (rot) weitere Unterschiede (gelb)
1. Seminar Nadja Kleisch Abb.5.: Vergleich der zentralen Stoffwechselwege in Bezug auf die Bernsteinsäureproduktion von E. coli und M. succiniproducens [8] Zielgene für knockout (rot) weitere Unterschiede (gelb) Succinat Dehydrogenase (sdhABCD) Malat Dehydrogenase (sfcA) Malat Dehydrogenase (mqo) Fumarat Hydratase (fumAB) Phosphattransferase System (ptsG) Pyruvat Oxidase (poxB) Glyoxylate shunt (aceBA) Acetyl CoA Synthase (acs) Pyruvatkinase F (pykF)

14 Metabolic Engineering
1. Seminar Nadja Kleisch Metabolic Engineering durch folgende knockout-Versuche # E. coli Stamm Mutationen W3110 / 1 W3110G ptsG 2 W3110GF ptsG und pykF 3 W3110GFO ptsG, pykF und mqo 4 W3110GFH ptsG, pykF und sdhA 5 W3110GFHO ptsG, pykF, mqo und sdhA 6 W3110GFHOE ptsG, pykF, mqo, sdhA und aceBA *Bernsteinsäure-Anteil = Bernsteinsäure/(Bernsteinsäure + Nebenprodukte )

15 keine Steigerung der Bernsteinsäureproduktion! Grund:
1. Seminar Nadja Kleisch keine Steigerung der Bernsteinsäureproduktion! Grund: nicht alle möglichen kombinatorischen Möglichkeiten sind bestimmt und getestet worden  nicht durchführbar daher: in silico knockout Experimente

16 In silico Vorhersage „genome-scale E. coli Model“ von Reed et al.[12]
1. Seminar Nadja Kleisch In silico Vorhersage „genome-scale E. coli Model“ von Reed et al.[12] ausgeschaltete Gene wurden gleich Null gesetzt Pyruvatkinase A und F können im Programm nicht auseinandergehalten werden  Inaktivierung beider Gene Vorhersagen: knockout von ptsG und pykFA führt zur 100fachen Steigerung zusätzliche Erhöhung durch Inaktivierung von pfl Gen möglich sdhA, mqo und aceBA haben keine Auswirkung auf die Produktion

17 Validierung Inaktivierung von ptsG und pykFA in E. coli Ergebnis:
1. Seminar Nadja Kleisch Validierung Inaktivierung von ptsG und pykFA in E. coli Ergebnis: nach 24 h anaeroben Wachstum 3,4fache Steigerung der Bernsteinsäureproduktion Nebenprodukte konnten reduziert werden aber: entspricht nicht der vorhergesagten Menge trotz Steigerung ist Ausbeute im Vergleich zu etablierten Produktionsstämmen gering 8,29 9,23 Bernsteinsäureration und 3,4fache Steigerung unterscheiden sich weil die Ratio im Bezug auf Nebenprodukte angegeben wird ist höher weil Nebenprodukte reduziert wurden. *Bernsteinsäure-Anteil = Bernsteinsäure/(Bernsteinsäure + Nebenprodukte )

18 Zusätzliche Optimierungen
1. Seminar Nadja Kleisch Zusätzliche Optimierungen Inaktivierung von pfl und ldhA bereits von Bunch et al. durchgeführt[10] W3110GFAP (knockout pfl): Reduktion der Essigsäurebildung keine Formiatbildung 2facher Anstieg von Milchsäurebildung 12,6fache Steigerung der Bernsteinsäure W3110GFAPL (knockout ldhA): schlechtes Wachstum unter anaeroben Bedingungen Ausbeute nicht so hoch wie bei W3110GFAP 9,23 12,6 11,53 weglassen…. zu lang *Bernsteinsäure-Anteil = Bernsteinsäure/(Bernsteinsäure + Nebenprodukte )

19 Pyruvat den größten Einfluss auf die
1. Seminar Nadja Kleisch Pyruvat den größten Einfluss auf die Bernsteinsäureproduktion haben die pyruvatformenden Enzyme (rot) aber auch die pyruvatverbrauchenden Enzyme (gelb) spielen eine Rolle steht kein Pyruvat zur Verfügung wird der metabolische Fluss in Richtung Bernsteinsäure gelenkt Verifizierung: Kultivierung der Mutante W3110GFA unter Zugabe von Pyruvat Gemischtsäuregärung ähnlich wie im Wildtyp Abb.6.: metabolische Stoffwechselwege von E. coli [8]

20 Zusammenfassung 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015
Im Vergleich zu random Mutationsverfahren, stellt dieser auf logic basierende Ansatz ei

21 1. Seminar Nadja Kleisch Stammoptimierung mittels komparative Analyse ist nur schwer möglich  lieferte lediglich Anhaltspunkte in silico Vorhersangen für Gen knockouts, erwiesen sich als gute Methode um Ziele für die Inaktivierung zu identifizieren trotz bestmöglicher Computersimulation können die Auswirkungen von Geninaktivierungen in vitro nicht exakt vorhergesagt werden mithilfe von zusätzlichen Optimierungen konnte eine finale Steigerung um das 12,6fache erreicht werden aber im Vergleich zu etablierten Produktionsstämmen immer noch gering Pyruvat spielt in der Bernsteinsäureproduktion eine essentielle Rolle Eine logik- und wissensbasierte Herangehensweise zur Stammoptimierung stellt eine interessante Alternative zur Zufallsmutagenese dar. Im Vergleich zu random Mutationsverfahren, stellt dieser auf logic basierende Ansatz ei

22 Literatur und Quellen 1. Seminar Nadja Kleisch 21.01.2015
[1] (zuletzt überprüft am ) [2] (zuletzt überprüft am ) [3] (zuletzt überprüft am ) [4] A. Cukolovic, C. V. Stevens: ”Feasibility of production methods for succinic acid: a marriage of renewable resources and chemical technology”, Biofuels, Bioproducts and Biorefining 2 (6), 2008; S ;  [5] H. Song  S.Y. Lee: „Production of succinic acid by bacterial fermentation “, Enzyme and Microbial Technology Volume 39, (3), 2006, 352–361 [6] P.C. Lee,  W.G. Lee,  S. Y. Lee* and H.N. Chang: „Succinic acid production with reduced by-product formation in the fermentation of Anaerobiospirillum succiniciproducens using glycerol as a carbon source“ , Biotechnology and Bioengineering, 2001, Volume 72, (1),  41–48 [7] P. Kuhnert, E. Scholten, S. Haefner, D. Mayor, J. Frey: “Basfia succiniciproducens gen. nov., sp. nov., a new member of the family Pasteurellaceae isolated from bovine rumen“, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009 [8] S. J. Lee, D.Y. Lee, T. Y. Kim, B. H. Kim, J. Lee, and S. Y. Lee: „Metabolic Engineering of Escherichia coli for Enhanced Production of Succinic Acid, Based on Genome Camparison and In Silico Gene Knockout Simulation“, Applied and Environmental Mikrobiology, 2005, [9] J. G. Zeikus,  M. K. Jain,  P. Elankovan: “Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products”. Applied Microbiology and Biotechnology, 1999, Volume 51 (5),  [10] P. K. Bunch, F. Mat-Jan, N. Lee, and D. P. Clark.: “The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli“, Microbiology, 1997, 43, 187–195 [11] Y. P. Chao and J. C. Liao: ”Alteration of growth yield by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in Escherichia coli“, Appl. Environ. Microbiol., :4261–4265 [12] J. L Reed, T. D. Vo, C. H. Schilling and B. O. Palsson: “An expanded genome-scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR)“, Genome Biol. 2003, 4, R54 [13] R Stellmacher, J. Hangebrauk, G. v. Abendroth, E. Scholten und C. Wittmann:»Fermentative Herstellung von Bernsteinsäure mit Basfia succiniciproducens DD1 in Serumflaschen“. Chemie Ingenieur Technik, 2010

23 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
1. Seminar Nadja Kleisch Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!