Transkription Grundlagen der Zellulären Biochemie

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1 Transkription Grundlagen der Zellulären Biochemie
Institut für biophysikalische Chemie Labor für Strukturanalyse Heike Pöpperl, PhD Grundlagen der Zellulären Biochemie Vorlesung zum Modul BCB P07 im Bachelor-Studiengang Biochemie Hannover Transkription

2 Einleitung Das Genom ist der Träger der Erbinformation.
“Informationseinheiten” des Genoms für funktionelle Moleküle werden als Gene bezeichnet. Das Konzept “Gen” hat sich im Lauf der Zeit verändert. Was ein Gen ist, ist nicht verbindlich festgelegt, umfasst aber im Allgemeinen genomische Sequenzen, die zu einem funktionellen Produkt führen: Transkribierte genomische Sequenzen und alle Regulationssequenzen; transkribierte genomische Sequenzen; nur transkribierte genomische Sequenzen, die die Information für das funktionelle Produkt tragen. Oft gibt es mehrere Transkripte für ein Gen, mehrere Varianten eines Produkts können hergestellt werden und eventuell enthält ein Transkript die Information für Produkte von mehr als einem Gen. 2007 Gerstein et al. (Genome Research 17: ).

3 Genexpression: Umsetzung der in der DNA enthaltenen Information in funktionelle Moleküle Informationsfluss: DNA  RNA  Protein DNA  RNA Francis Crick, 1958: Zentrales “Dogma” der Molekularbiologie Replikation Genexpression Transkription Translation Regulation Regulation Regulation Regulation

4 Transkription “Abschrift”. Die Nukleotidsequenz eines DNA-Abschnitts wird in die Nukleotidsequenz einsträngiger RNA-Moleküle überführt. Grundlage: Paarung komplementärer Basen (Watson-Crick-Basenpaarung/Standardbasenpaarung). Zellen generieren unterschiedliche Transkripte, abhängig von Zelltyp, Umweltbedingungen, Entwicklungs- oder Differenzierungsstatus. Komplexe Regulation, vor allem bei Eukaryoten.

5 Transkription Translation mRNA Codierende RNA Messenger-RNA (mRNA):
Nicht-codierende RNA-Moleküle Transfer-RNA (tRNA): Proteinsynthese, transportiert aktivierte Aminosäure. ribosomale RNA (rRNA): Struktureller und funktioneller Bestandteil der Ribosomen. Kleine nukleäre RNA-Moleküle/small nuclearRNA (snRNA): Spleißen. Kleine RNA-Moleküle im Nukleolus (snoRNA): rRNA-Prozessierung RNA-Bestandteile von Telomerase (Replikation von Chromosomenenden) und Signalerkennungspartikel (Synthese von Membran- oder Exportproteinen), RNAseP und anderen Riboproteinen. Mikro-RNA (miRNA): Regulation der Translation. Lange nicht-codierende RNA (lncRNA): zB Regulation der Transkription, beim Großteil ist eine Funktion bisher nicht bekannt. mRNA

6 Arten und Eigenschaften der RNA-Transkripte in E.coli
Synthese- anteil Masse- anteil Art Funktion Anzahl t1/2 mRNA Proteinbildung >1000 40-50% 3% 1-3 min (23S 3 16S 5S) rRNA Ribosomen 50% 90% stabil tRNA Adaptor 60 3% 7% stabil RNAseP- RNA Katalyse 1 < 1% < 1% ?

7 DNA-abhängige RNA-Polymerasen (RNAPs)
erkennen definierte Startsequenzen (Promotoren) über temporäre Untereinheiten; katalysieren die Polymerisation von Ribonukleotiden (A,C,G,U) an einer DNA-Matrize (template): (RNA)n Nukleotide + NTP (RNA)n+1 + PPi benötigen keinen Primer; Synthese der RNA 5‘ nach 3‘. Codierender Strang (sense strand) ATGCTGAAA 3‘ 5‘ AUGCUGAAA 5‘ RNA TACGACTTT 5‘ 3‘ Matrizenstrang Codogener Strang (antisense strand, template strand)

8 Transkription in Bakterien
w b’ s a b RNA-Polymerase (RNAP) Zusammensetzung des Holoenzyms (Initiation): a2bb’ws Zusammensetzung des “core” Enzyms (Elongation): a2bb’w a-Untereinheit: Interaktion mit regulatorischen Proteinen und/oder DNA b-Untereinheiten: katalytisches Zentrum w-Untereinheit: Konformation von b’ s-Untereinheit: Promotor Spezifität (kontrolliert die Bindung an DNA Konsensussequenzen der Promotor) Bakterien haben häufig verschiedene s-Faktoren.

9 Transkription in Bakterien
Die Transkription wird in drei Phasen unterteilt: Initiation Elongation Termination

10 Initiation Promotorerkennung und -bindung durch den s-Faktor
geschlossener Komplex Promotor w b’ s a b w pppApN „Schmelzen“ von AT-Paaren, offener Komplex, RNA-Synthese 5’ w 5’ scrunching w 5’ Promotorloslösung (promoter escape)

11 Promotoren in Escherichia coli
codierender Strang

12 Initiation Promotorbindung durch das Holoenzym (geschlossener Komplex) (Strukturen der RNAPs aus Thermus thermophilus und Thermus aquaticus) a b b’ w

13 b’ a b Initiation/Elongation w Core-Enzym: Elongation
Holoenzym: Initiation (hier: geschlossener Komplex) Core-Enzym: Elongation RNA Codierender Strang Matritzenstrang aktives Zentrum mit Mg2+ Codierender Strang Matritzenstrang a b b’ w (Strukturen der RNAPs aus Thermus aquaticus und Thermus thermophilus)

14 Inhibition der Initiation in Bakterien durch Rifamycin
w Promoter b’ s a b pppApN R R nach Kettenstart 5’

15 Elongation in Bakterien
w 5’ b’ a b 5’ RNA RNA wird in 5‘ ‘ Richtung synthetisiert

16 Bewegung der Transkriptionsblase entlang der DNA (1)
Die RNA-Polymerase arbeitet an der DNA entlang und folgt den helikalen Windungen der DNA  Verdrillung von RNA und DNA

17 Bewegung der Transkriptionsblase entlang der DNA (2)
Die RNA-Polymerase ist verankert und zieht die DNA durch:  negativer Supercoil hinter, positiver vor der RNA-Polymerase negativer supercoil positiver supercoil erneute Windung durch Topoisomerase Entwindung durch Topoisomerase Versuche mit E. coli Topoisomerasemutanten sprechen für diese Variante.

18 Inhibition der Elongation durch den Interkalator Actinomycin D
Zytostatikum zur Behandlung von Krebserkrankungen Zyklische Peptide binden in der kleinen Furche Phenoxazon- Ringsystem interkaliert Verzerrt die DNA-Struktur; inhibiert die Transkription und in höheren Dosen auch die Replikation

19 Termination der Transkription in Bakterien Rho-abhängige Termination
Rho-Protein ist eine RNA-abhängige ATPase, Helikase (Hexamer) RNA (U12) (UC)4(nur ein UC sichtbar) NTP-Analog offener Ring geschlossener Ring

20 Termination der Transkription Rho-abhängige Termination
Rho bindet an eine C-reiche Erkennungssequenz der neu synthetisierten RNA. Bewegt sich in 5‘  3‘ Richtung entlang der RNA. Entwindet RNA-DNA oder RNA-RNA doppelhelikale Bereiche unter Spaltung von NTP  NDP + Pi. RNA wird vom DNA-Strang abgelöst. w 5’ RNA NTP NDP + Pi 5’ RNA

21 Termination der Transkription
Rho-unabhängige Termination, spontane Termination U-reiche Sequenz (dA rU) Paarungen sind besonders instabil RNA: GC-reiches Palindrom formt hairpin RNAP pausiert und RNA- Bindung wird durch Hairpin destabilisiert. Der Sequenzkontext des Terminators ist ebenfalls wichtig.

22 Transkription in Eukaryoten
Drei verschiedene RNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Aufgaben: RNAP I (Pol I, RNAP A): Nucleolus, ribosomale (r)RNA RNAP II (Pol II, RNAP B): messenger (m)RNA, non coding (nc)RNAs, kleine RNAs, zB small nuclear (sn)RNAs und small nucleolar (sno)RNAs RNAP III (Pol III, RNAP C): transfer (t)RNAs, 5S rRNA, U6 snRNA RNAPI und RNAP III transkribieren eine überschaubare Anzahl von Genen: Promotoren mit wenigen Erkennungssequenzen für RNA-Polymerase und zusätzliche Faktoren. Termination der Transkription an bestimmten Sequenzen “kurz” hinter dem prozessierten 3’ Ende (downstream) des Transkripts. RNAP II: Am intensivsten untersucht ist die Erzeugung von mRNA Molekülen. Initiation, Elongation und Termination der mRNA-Synthese sind sehr komplex, wobei die eigentliche Termination der Transkription nicht gut charakterisiert ist.

23 Eukaryotische RNA-Polymerasen (Hefe)
Inhibitoren a-Amanitin (a-Amanitin) Rifamycin RNAP I RNAP II RNAP III RNAP (Bakt) A190 Rpb1 C160 b’ A135 Rpb2 C128 b AC40 Rpb3 a AC19 Rpb11 Rpb6 w Rpb5 Rpb8 Rpb10 Rpb12 A12.2 (N) Rpb9 C11 (N) A14 Rpb4 C17 A43 Rpb7 C25 +2 +4 b’ a b w

24 Transkription von Protein-codierenden Genen (prä-mRNA)
RNA-Polymerase II Transkription von Protein-codierenden Genen (prä-mRNA) RNAP II besteht aus 12 UE. In Hefe sind nicht alle UE der RNAP II unter allen Bedingungen essenziell und in stöchiometrischen Mengen vorhanden (zB Rpb4 und Rpb7). Eine Besonderheit der RNAP II ist die C-terminale Domäne (CTD) der Rpb1 UE (Homolog der b’ UE in Bakterien). Die CTD besteht aus 26 (in Hefe) bis 52 (beim Menschen) Wiederholungen der Heptamersequenz YSPTSPS. Während der Transkription erfolgt eine reversible Phosphorylierung und Dephosphorylierung durch CTD Kinasen und Phosphatasen, was Erkennungsmuster für verschiedene Proteine und Proteinkomplexe erzeugt. Die CTD hat wichtige regulatorische Aufgaben in jeder Phase der Transkription und bei Prozessierungsschritten der prä-mRNA (Capping, Spleißen, Polyadenylierung).

25 Die CTD der RNA-Polymerase II
Konsensussequenz: (Tyr1Ser2Pro3Thr4Ser5Pro6Ser7)26-52 Ser, Tyr und Thr werden reversibel an der OH-Gruppe phosphoryliert. Am besten Untersucht ist die Rolle der Ser-Phosphorylierung Start Termination Elongation pA ChIP-Anreicherung S5-P S2-P S7-P Hypo-P Mediator Chem. Rev , 8456 pp S5-P Capping-Enzyme S2-P Enzyme für die 3‘-Prozessierung Hyper-P Spleiß-Faktoren

26 RNA-Polymerase II Rpb1 CTD nicht sichtbar, da ungeordnet
w ohne 4 und RNAP Bakterien Mg2+ (hier Mn2+) Zn2+

27 RNA-Polymerase II: RNA-Synthese
einkommendes NTP gepaartes NTP Trigger loop Brückenhelix Knollenblätterpilz:

28 Generelle Transkriptionsfaktoren
Eukaryotische RNA-Polymerasen binden über generelle Transkriptionsfaktoren (GTFs) an ihre Promotoren (Beispiel: Hefe) RNAP I Core-Faktor: TBP Rrn7 Rrn6 Rrn11 A49 (N) A34.5 A49 (C) u.a. RNAP II TFIID: TBP TAFs (14) TFIIB TFIIF: TFIIFa TFIIFb TFIIE: TFIIEa TFIIEb TFIIA (3 UE) TFIIH (10 UE) (Mediator-Komplex) RNAP III TFIIIB: TBP BrF1 B‘‘ C37 C53 (C82) (C34) C31 u.a. Funktion DNA (TATA)-Bindung Promotorbindung DNA-/TBP-/Polymerase-bindung/Startstellen-auswahl Startstelle, Elongation offener Komplex Stabilisierung der TBP-Bindung Helikase, Kinase

29 DNA-Bindung von TBP (TATA-bindendes Protein) und TFIIB
bindet in der schmalen Furche, verzerrt die Helix

30 Häufige Elemente eines RNAP II-“core“-Promotors
TFIID/Tafs TBP TFIIB

31 RNAP II-Rekrutierung Bindung von TFIID TFIIA und TFIIB
Rekrutierung von RNAP II mit TFIIF Bindung der von TFIIE und TFIIH geschlossener Präinitiationskomplex (PIC) ATP-abhängige Öffnung der DNA durch die XPB UE von TFIIH offener PIC Mediator TBP Tafs ADP + Pi ATP TFIIH TFIIH RNAP II CTD TFIIE TFIID TFIIB TFIIA TFIIF

32 Initiation/Elongation
Phosphorylierung der CTD an Ser5 Initiation der mRNA Synthese Mediator ADP ATP ADP ATP TFIIH TFIIH P P P RNAP II CTD RNAP II CTD TFIIE TFIIE TFIID TFIIB TFIIA TFIIF TFIIF PPi NTP

33 Elongation Lösung der RNAP II von GTFs und Mediator
Modifizierung des 5‘ Endes (Capping) Mediator TFIIH P P 5‘ Cap P RNAP II CTD RNAP II CTD P TFIIE TFIID TFIIB TFIIA TFIIF TFIIF PPi NTP PPi NTP

34 Elongation:Pausieren
Pausieren der RNAP II in Promotornähe: häufig nach 30 – 60 Nukleotiden bewirkt durch negative Elongationsfaktoren wie: Negative elongation factor (NELF) und DRB-sensitivity-inducing factor (DSIF) Mögliche Funktion des Pausierens: Regulationsschritt „Offenhalten“ des Promotors Capping der mRNA Effiziente Elongation/ Beendigung des Pausierens benötigt P-TEFb (positive transcription elongation factor b). P-TEFb: ist Bestandteil des Super-Elongationskomplexes (SEC) kann über den Mediator, Transkriptionsfaktoren und andere Proteinkomplexe zur RNAP II gebracht werden besteht aus Cyclin T1 und CDK9 CDK9 Kinase UE phosphoryliert NELF (dissoziiert), phosphoryliert DSIF (wird zum positiven Elongationsfaktor) und phosphoryliert RNAP II CTD (Rpb1 UE) an Ser2 der Heptamereinheiten. Mediator SEC ADP ATP P-TEFb 5‘ Cap P P P RNAP II CTD P P TFIID DSIF TFIIB P TFIIA NELF PPi NTP Elongation

35 3‘-Modifikation der prä-mRNA
(gekoppelt mit Termination der Transkription) 5‘ Cap PPi ATP AAAA Im Verlauf der Elongation ändert sich das Phosphorylierungsmuster der CTD. Die Ser5-Phosphorylierung wird entfernt. PAP CPSF AAUAAA P CstF P RNAP II CTD P GU-reich Ein Polyadenylierungskomplex bindet über CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) und CstF (cleavage stimulating factor) an die Ser2-phosphorylierte CTD. CSTF erkennt das Polyadenylierungssignal AAUAAA auf der neusynthetisierten RNA und CStF eine GU-reiche Sequenz. Die RNA wird etwa 25 Nukleotide hinter dem Polyadenylierungssignal durch eine Endonuclease gespalten. PAP (Poly(A)-Polymerase) polyadenyliert das freie 3‘-Ende.

36 3‘-Modifikation der prä-mRNA
(gekoppelt mit Termination der Transkription) PPi ATP AAAAAAAAAAAAA 5‘ Cap AAAA PABII PABP PABII PABII PABP PAP CPSF P CstF RNAP II CTD P PABII Moleküle binden an die Poly(A)-Sequenz und schützen den Poly(A)-Schwanz vor Abbau. Im Zytoplasma wird PABII durch PABP ersetzt (wichtig für die Initation der Translation).

37 Termination der Transkription
Torpedomodell Rat1 CPSF RNAP II CTD Rat1 P CstF P Rat1 RNAP II CTD RNAP II CTD Rat1 Der Polyadenylierungskomplex rekrutiert die 5‘-3‘ Exonuklease Rat1 (Xrn2 in Säugern). RNAP II transkribiert weiter, pausiert an bestimmten Stellen. Rat1 baut die RNA vom ungeschützten 5‘ Ende (keine Cap-Struktur) her ab. Wenn die Exonuklease die RNAP II eingeholt hat, kann sie, wahrscheinlich zusammen mit anderen Proteinen, die RNAP II von RNA und DNA trennen und damit die Transkription beenden.

38 5‘-Modifikation der prä-mRNA (Capping)
Initiation/Elongation: Sobald die prä-mRNA zugänglich wird, wird sie mit einem umgekehrt eingebauten (5´- 5´) Guanylat modifiziert (capping). Capping-Enzym und Guanin-7-Methyltransferase binden die Ser5-phosphorylierte RNAP II CTD. 1. Hydrolyse der 5‘ Triphosphatgruppe zur Diphosphatgruppe durch das Capping-Enzym (RNA-Triphosphatase-Funktion) 2. Guanylierung durch Capping-Enzym (Guanylyltransferase-Funktion) unter Verbrauch von GTP und Freisetzung von PPi, Bildung einer ungewöhnlichen 5‘,5‘ Triphosphatbindung (Kappe, Cap) Gecapptes 5´-Ende 5´-Ende des naszierenden Transkripts GTP

39 Methylierung der Cap-Struktur
Methylierung des 5‘-ständigen Guanosins an N7 durch Guanin-7-Methyltransferase mit einer Methylgruppe aus S-Adenosylmethionin (SAM). Oft weitere Methylierungen der ersten zwei Nukleotide der RNA. Durch 2‘-O-Methyltransferase (SAM als Methyldonor)

40 Spleißen der prä-mRNA Gruppen von Phillip Sharp und Richard Roberts (1977): Bei Strukturgenen der Eukaryoten sind codierende Bereiche (Exons) von nicht-codierenden Bereichen (Introns) unterbrochen. Diese nicht-codierenden Sequenzen werden transkribiert und aus der prä-mRNA herausgschnitten. Diesen Vorgang nennt man Spleißen. Beispiel: Ovalbumingen EM-Präparat

41 Arten von Introns Introns in Strukturgenen (transkribiert als prä-mRNA) sind typisch für höhere Eukaryoten und seltener in Hefe. U2-Introns (GU-AG Introns) oder seltener: U12-Introns (AU-AC Introns); benannt nach beteiligten snRNPs bzw den Sequenzen an den Enden des Introns. Spleißen im Spleißosom durch snRNPs (snRNAs haben Ribozymfunktion). Selbstspleißende Introns der Gruppen I und II Hauptsächlich Transkripte für rRNA und tRNA der Organellen und in Bakterien. Einige in nukleären Transkripten aber nicht in Vertebraten. Spleißen durch Ribozymfunktion der Transkript-RNA (Introns der Gruppe III in Plastiden, spleißen durch RNPs) Eukaryotische prä-tRNA-Introns werden durch Proteine (Endonuclease, Ligase) gespleißt. Introns der Archäen. Introns in prä-rRNA-, prä-tRNA- und prä-mRNA- Transkripten von Archäen werden durch Proteine (Endonuclease, Ligase) gespleißt.

42 Spleißen der prä-mRNA Konsensussequenzen (Intron) für den Spleißvorgang: Anfang des Introns (5‘ Spleißstelle): invariantes GU, Ende des Introns (3‘ Spleißstelle): invariantes AG 11 Pyrimidinnukleotide (vorwiegend) vor der 3‘ Spleißstelle Außerdem gibt es eine Verzweigungsstelle (nicht gezeigt) in der Nähe des 3‘ Endes Hefe: UACUAAC, Vertebraten: YNCURAY Während Exons beim Menschen durchschnittlich 150 Nukleotide lang sind, beträgt die Länge der Introns durchschnittlich 3500 Nukleotide.

43 Spleißen der prä-mRNA Das Spleißen geschieht in zwei Schritten:
1. Umesterung des 5‘-Phosphats auf die 2‘ OH-Gruppe des Adenosins an der Verzweigungsstelle unter Bildung einer 2´-5´-Phosphoesterbindung. Bildung des Lariats und Freisetzung von Exon 1 2. Erneute Umesterung unter Bildung einer 3´-5´ -Phosphoesterbindung zum Verknüpfen beider Exons und Freisetzung des Introns in der Lariatform. Der Spleißvorgang muss sehr präzise ablaufen, da sonst nicht das richtige Leseraster für das Protein entsteht.

44 Spleißen der prä-mRNA Spleißen der prä-mRNA findet im Spleißosom statt. Ein Spleißosom wird an der prä-mRNA aus snRNPs („snörps“, small nuclear ribonucleoproteins) und vielen zusätzlichen Proteinen (splicing-associated factors) zusammengebaut. Splicing-associated factors: zB BBP (branch point-binding factor); U2AF (U2 snRNP auxiliary factor). Die fünf snRNPs: U1-snRNP, U2-snRNP, U4-snRNP, U5-snRNP, U6-snRNP) enthalten jeweils eine Nukleotid lange RNA (U1, U2, U4, U5, U6), sowie ca 10 Polypeptide. Die Erkennung der Spleißstellen und die beiden Umesterungen werden durch die snRNAs der snRNPs durchgeführt (Spleißen ist (wahrscheinlich) ein Ribozym-katalysierter Vorgang). Die Größe eines Spleißosoms ist mit der eines Ribosoms vergleichbar. Spleißen findet cotranslational in 5‘-3‘ Richtung statt, wobei manche Spleißfaktoren an die hyperphosphorylierte CTD der RNAP II binden.

45 Spleißosom-Zyklus (snRNPs)
U1 bindet an die 5‘ Spleißstelle U2 bindet an die Verzweigungsstelle der U4/U5/U6-Komplex bindet, U5 bindet die 3‘ und 5‘-Spleißstellen U1 und U4 werden freigesetzt; aktiviertesSpleißosom Freisetzung des Introns und Dissoziation der snRNPs Freisetzung der mRNA 2. Umesterung; Verknüpfung der Exons 1. Umesterung; Lariat Es finden Konformations-änderungenen im Spleißosom statt.

46 Konformationsänderungen im Spleißosom:
Beispiel: Veränderungen der snRNA-Basenpaarungen, die zur 1. Umesterung führen: Austausch von U1 durch U6 an der 5‘ Spleißstelle (1). Austausch von BBP durch Basenpaarung von U2 mit der Verzweigungsstelle (2), alternative Paarung innerhalb von U2 (3). Freisetzung von U4 durch alternative Basenpaarungen von U6, sowohl intramolekular (4) als auch mit U2 (5,6) (genaue Reihenfolge ist nicht bekannt). 1. Umesterung

47 Spleißosom-Zyklus Alternative RNA-Konformationen werden durch RNA-abhängige ATPasen/Helikasen (mit DExD/H-Box) und Snu114 GTPase ermöglicht. Diese Proteine gehören zu den Splice-associated factors. Gezeigt sind die Komponenten aus Hefe.

48 snRNPs des Spleißosoms
U1-snRNP, U2-snRNP, U4-snRNP, U5-snRNP, U6-snRNP Uridinreiche snRNA, daher „U“ und Proteine: Alle außer U6-snRNP haben das gleiche core-Protein aus sieben Sm-Proteinen und jeweils snRNP-spezifische Proteine. U6-snRNP hat mit den Sm-Proteinen verwandte Proteine: L(ike)Sm-Proteine Sm Proteine: Smith-Proteine benannt nach einer Patientin in deren Serum Antigene gegen den Sm-Komplex nachgewiesen wurden (Autoimmunkrankheit systemischer Lupus Erythematosus) Sm-B/Sm-B′, Sm-D1, Sm-D2, Sm-D3, Sm-E, Sm-F, und Sm-G Ein alternatives Spleißosom mit anderen snRNPs (U5-, U11-, U12-, U4atac-, U6atac-snRNP) existiert für die selteneren U12-Introns (AU-AC Introns; ca 0,3% der Introns). Funktion: möglicherweise Regulation der Expression von bestimmten Gengruppen.

49 snRNPs des Spleißosoms
An der snRNA formen die sieben Sm-Proteine einen Ring (hauptsächlich antiparalleles b-Faltblatt) um das Sm-Erkennungsmotiv der U1-snRNA. U1-snRNP hat neben den Sm-Proteinen noch drei spezifische Proteine: U1-70K, U1-C und U1-A, (welches in der Struktur fehlt, weil die U1-snRNA für die Kristallisation gekürzt wurde)

50 snRNPs des Spleißosoms
Ring aus Sm-Proteinen um das Sm-Erkennungsmotiv der U1-snRNA Zn2+ Sekundärstruktur der U1-snRNA Ring aus 7 Sm-Proteinen

51 Alternatives Spleißen
alpha Tropomyosin aus Ratte: gewebespezifische Spleißvarianten

52 Alternatives Spleißen
Geschlechtsbestimmung in Drosophila Die Ausprägung der Geschlechtsmerkmale in Drosophila wird durch alternatives Spleißen geregelt. 1. Transformer (tra) prä-mRNA: Alternativ gespleißtes 2. Exon durch „Silencing“ In männlichen Fliegen wird die erste 3‘-Spleißstelle (proximale Spleißstelle) im ersten Intron benutzt (Standardmechanismus, default pathway). Der Spleißfaktor U2AF bindet an die pyrimidinreiche Sequenz vor der 3‘-Spleißstelle (hilft bei der Erkennung der Verzeigungsstelle durch U2-snRNP). Das resultierende Exon2 enthält ein Stoppcodon im Leseraster und es entsteht ein verkürztes, nicht funktionelles Protein. Weibliche Fliegen exprimieren das geschlechtsspezifische slx (sex lethal) Gen und somit das SXL Protein. SXL bindet spezifisch an die pyrimidinreiche Sequenz der ersten Spleißstelle und maskiert sie (intronischer Spleiß-Silencer). U2AF bindet an die weiter distal gelegene alternative 3‘-Spleißstelle. Das resultierende Exon2 ist kürzer und enthält kein Stoppcodon. Dieses Transkript codiert das funktionelle TRA-Protein.

53 Alternatives Spleißen
Geschlechtsbestimmung in Drosophila 2. Doublesex (dsx) prä-mRNA: Aktivierung einer Spleißstelle durch exonische Spleiß-Enhancer In weiblichen Fliegen, die das TRA Protein produzieren, bindet TRA zusammen mit RBP1 Und TRA2 an die Spleißenhancer in Exon4. Dadurch kann die Spleißstelle für Exon 4 genutzt werden. Das dsx-Transkript in weiblichen Fliegen wird nach Exon4 polyadenyliert und codiert für DSX-F, das spezifisch für weibliche Fliegen ist und die Expression von Genen für den männlichen Phänotyp reprimiert. Die 3‘-Spleißstelle für Exon4 hat eine suboptimale pyrimidinreiche Sequenz, die nicht von U2AF gebunden wird. Der reguläre Spleißvorgang, der in männlichen Fliegen stattfindet, überspringt Exon4 (exon skipping). Das resultierende Protein DSX-M ist ein Repressor für Gene, die für einen weiblichen Phänotyp nötig sind. Exon4 besitzt sechs exonische Spleiß-Enhancer pA

54 Alternatives Spleißen durch einen Riboswitch
Thiaminpyrophosphat-(TPP)-Riboswitch in Neurospora crassa: Niedrige TPP-Konzentration: Riboswitch-Struktur im Intron im 5‘-untranslatierten Bereich des NMT1 Gens blockiert die 2. 5‘-Spleißstelle durch Basenpaarung. Die erste 5‘-Spleißstelle wird effektiv benutzt, das NMT1-Transkript codiert das NMT1 Protein. Hohe TTP-Konzentration: TPP bindet an den Riboswitch und verändert dessen Struktur. Die 2. 5‘-Spleißstelle wird frei und benutzt. Die Verzweigungsstelle wird verdeckt. Das Spleißen ist ineffektiv. Ungespleißte Transkripte und das Transkript, welches die 2. 5‘-Spleißstelle benutzt, enthalten AUG-Codons. Es werden kurze Peptide synthetisiert. Wenig Translation vom NMT1 Startcodon.

55 Funktion von Introns und Spleißen
Introns sind in höheren Eukaryoten sehr häufig (im Durchschnitt 8 pro Gen beim Menschen). In Vertebraten haben von den Strukturgenen nur die Gene für Histone und Interferone keine Introns. In Hefe (Saccharomyces cerevisiae) haben weniger als 5% der Strukturgene ein Intron. Es wird angenommen, dass am Beginn der eukaryotischen Entwicklung ein intronreicher Organismus stand. Mögliche Vorteile von Introns: Schnellere Evolution durch Neukombination von Proteindomänen (Domain-shuffling). Größere Anzahl von Proteinen durch alternatives Spleißen Der Spleißvorgang ist mit der Transkription, Prozessierung der mRNA und ihrem Transport ins Zytoplasma eng verbunden. Gene ohne Introns werden in höheren Eukaryoten oft nicht effizient exprimiert.

56 Abbau von mRNA Bakterien (E. coli)
Endonuclease RNaseE, Exonuclease Polynukleotidphosphorylase (PNPase), RNA-Helikase und andere Proteine bilden ein Degradosome. mRNA mit Monophosphat am 5‘-Ende wird abgebaut. Der Abbau kann schon vor Ende der Transkription starten. T1/2 < 3 Minuten Eukaryoten 5‘-Ende und 3‘-Ende sind modifiziert und werden von spezifischen Proteinen/Proteinkomplexen gebunden: Cap-bindendes Protein und poly(A) bindendes Protein PABP. Beide binden an eIF4G und zirkularisieren die mRNA. Die mRNA ist vor Abbau durch Exonucleasen geschützt. Die poly(A)-Sequenz wird nach und nach durch 3‘-5‘ Exonucleasen verkürzt bis kein PABP mehr binden kann. Dies ist ein Signal für Decapping-Enzym. Die Cap-Struktur wird abgespalten und die mRNA wird ein Substrat für die 5‘-3‘ Exonuclease Xrn1 und den 3‘-5‘-Exosom-Komplex. Zusätzliche Determinanten für die mRNA-Stabilität befinden sich auf der mRNA. Eine AU-reiche Sequenz in der 3‘-untranslatierten Region (3‘ UTR) wirkt oft destabilisierend. T1/2 für eukaryotische mRNA: Minuten bis Stunden/Tage