Vorlesung: Andrologie und instrumentelle Samenübertragung Wintersemester 2006/7, 7. Fachsemester - Spermagewinnung - Herstellung von Besamungsportionen - Verdünner - Kryobiologie

Samenübertragung beim Pferd im arabischen Schrifttum für 1286 datiert Entdeckung der menschlichen Spermien Antoni van Leeuwenhoek ( )

Erste erfolgreiche Besamung bei einem Säugetier im Jahre 1780 an einer Hündin Lazzaro Spallanzani ( ) Karl-Ernst von Baer ( ) Entdeckung der Eizelle 1827 bei einer Hündin Entwicklung einer künstlichen Vagina für Hunde 1914 durch einen italienischen Physiologen

Ab 1900 umfangreiche Versuche zur künstlichen Besamung in Russland/UdSSR Erste Versuche an Meerschweinchen, Kaninchen und Hunden 1932: künstliche Besamung bei Schafen und Rindern

In Deutschland Weiterentwicklung vor allem in Hannover - eindeutiger Schwerpunkt beim Nutztier - Bekämpfung von Deckseuchen Erste deutsche Besamungsstation 1943 in Pinneberg

Heutige Situation - Deutschland Milchrind % der Kühe und Färsen Schwein pro Jahr werden zwischen 5 – 6 Millionen Spermaportionen verkauft Warmblutpferd Anteil der Besamungen liegt mehr als dreimal so hoch wie der Natursprung

Schritte der Herstellung einer Besamungsportion - Spermagewinnung - Spermabeurteilung - Spermaverarbeitung - Verdünnung - Berechnung des Verdünnungsgrades - Verdünnungsvorgang - Konfektionierung u. Kennzeichnung - Glasampullen - Pellets - Pailletten - sonstige Plastikgefäße - Lagerung - Spermaverbrauch - Entnahme - Handling bis zur Besamung - Besamung

Arten von Besamungsportionen Direkte Übertragung nach der Gewinnung Nativsperma Verlängerung der Haltbarkeit durch Zusatz von Verdünnern und Kühlung flüssigkonserviertes Sperma Verlängerung der Haltbarkeit durch Zusatz von Verdünnern, Kryoprotektiva und Tiefgefrierung bei -196°C tiefgefrierkonserviertes Sperma

Nativsamen Vorteile: - wenig Aufwand (Verarbeitung, Besamungstechnik) - geringe Schädigung der Spermien (gute Befruchtungskompetenz) - leichte Besamungstechnik Nachteile: - Besamungsportion muss sofort versamt werden - örtliche und zeitliche Bindung Typische Situation: - Hündin lässt Rüden trotz richtigem Besamungszeitpunkt nicht decken - Rüde wird abgesamt – Hündin wird besamt

flüssigkonserviertes Sperma Prinzip: - durch Zugabe von Verdünnern und Kühlung wird die Besamungsportion bis etwa 3 Tage konserviert - beste Ergebnisse innerhalb von 48 Std. nach der Gewinnung Vorteile: - kein direkter Kontakt von Zuchttieren notwendig - Vermeidung von zeit- und kostenaufwendigen Fahrten - Verminderung des Infektionsrisikos Nachteile: - Fehler in der Samenhandhabung führen zum Leerbleiben - höhere Anforderungen an die Besamungstechnik

Tiefgefriersperma Prinzip: - durch Zugabe von Verdünnern, Kryoprotektiva, schrittweise Kühlung und Gefrierung in flüssigem Stickstoff bei -196°C wird der Samen konserviert Vorteile: - unendliche Lagerungsdauer möglich (3000 – Jahre) - keine Begrenzung von Zeit und Ort - Anlage von Genbanken möglich Nachteile: - Schädigung der Samenzellen (Verlust von 20 – 50 %) - hohe Anforderungen an die Besamungstechnik - nicht jedes Vatertier ist geeignet

Spermagewinnung - Methode beeinflusst die Qualität des Ejakulates (negative Erfahrungen, Volumen und Dichte, Stimulation) Zwei Methoden: - Elektroejakulation ohne Auslösung der Paarungsreflexkette - Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette Prinzip der Elektroejakulation - Einführen einer bioplaren Elektrode in das leere Rektum - mehrmalige elektrische Reizung mit steigender Stromstärke (Bulle: 0 auf 40 – 60 mA, Spannung bei 10 – 30 Volt) - Möglichkeit der Ejakulation ohne Erektion – Ejakulat tropft aus der Präputialöffnung ab

Spermagewinnung Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette Ablauf:- Auslösung der natürlichen Paarungsreflexkette - Schlüsselreize (visuell, olfaktorisch, mechanisch) - mit natürlichem Sprungpartner - weiblich - im Östrus - nicht im Östrus - männlich - mit einer Attrappe, die den Schlüsselreiz vermittelt (Phantom) - allein durch manuelle Stimulation

Spermagewinnung

Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette Methoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina - manuelle Methode

Spermagewinnung Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette Methoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina - Mantelrohr z. B. aus Hartgummi - Innenschlauch z. B. aus Latex - Samenauffangglas - Gummiringe - Ventil - Gleitmittel - Latextrichter

Spermagewinnung Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette Methoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina

Spermagewinnung Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette Methoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina

Spermagewinnung Nutzung der natürlichen Paarungsreflexkette Methoden: - Nutzung einer künstlichen Vagina Schlüsselreize: - Temperatur (zwischen °C) - Druck - Gleitvermögen - Wärmeschrank (Cave: Keimvermehrung) - Wasser (Cave: spermizid) - Alternativ: Luft

Spermabeurteilung - siehe Spermatologische Untersuchung Spermaverarbeitung Ziel: Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit über einen möglichst langen Zeitraum Verdünnung - ausgehend von der Dichte des Ejakulates - Zusatz von Verdünnern: - Volumenvergrößerung - Nährstoffe (Glukose, Fruktose) - Schutzstoffe: Eidotter und synthetische - Kryoprotektiva - Erhaltung des osmotischen Druckes ( mOsm/l) - Pufferkapazität (pH: 6-7) - Verhinderung von Keimvermehrung - Volumenvergrößerung - Konservierung

Kryoprotektiva - Glycerin: am häufigsten eingesetzt, aber auch zytotoxisch (1 – 3 %) - DMSO:Bedeutung beim Kaninchen Warum Zusatz von Kryoprotektiva? Reduzierung der Zellschäden durch - Kühlschäden - Gefrierschäden Schäden vor allem im Bereich der Plasmamembran und des Akrosom

Kühlschäden - Strukturelle Veränderungen der Plasmamembran im Temperaturbereich 17°C bis 4°C - sehr empfindlich sind Eberspermien - Reduktion der Schäden durch Zusatz von Schutzkolloiden - Schädigungsfaktoren: - Wasserentzug durch extrazelluläre Eisbildung – Zerstörung der Isotonie – Anreicherung von Stoffen in der Zelle, die nicht durch die Plasmamembran durchtreten können. - Intrazelluläre Eisbildung - Zwischen -5 °C und -15 °C setzt die extrazelluläre Eisbildung ein Gefrierschäden Beim Einfrieren und Auftauen

Exosmose: Entzug von Wasser durch extrazelluläre Eisbildung intrazelluläre Eisbildung Aus: Busch et al., 1993 Beides soll in seinen negativen Auswirkungen reduziert werden

Exosmose: Entzug von Wasser durch extrazelluläre Eisbildung intrazelluläre Eisbildung Beides soll in seinen negativen Auswirkungen reduziert werden - Zusatz von Kryoprotektiva - Zeitkurve der Einfrierung: - schnelles Einfrieren: vermehrt intrazelluläre Eisbildung - langsames Einfrieren:Exosmose, Lösungseffekt

Verdünnung -Temperaturangleichung von Samen und Verdünner - Beachtung bestimmter Haltezeiten (Äquilibrierung – bei TGS) 1.Berechnung der erforderlichen Verdünnermenge - erforderliche Gesamtspermienzahl pro Portion - Anteil der zu erwartenden vorwärtsbeweglichen Spermien zum Zeitpunkt der Besamung 2.Bestimmung des Endvolumens nach Verdünnung Gesamtspermienzahl x Vorwärtsbewegung Faktor x Spermien pro Besamungsdosis = Anzahl Samenportionen Anzahl Samenportionen x Volumen Portion = Endvolumen nach Verdünnung u. a.: Verhältnis Samen:Verdünner

Verdünnung (Beispiel: Flüssigkonservierung Rüde) 1.Berechnung der erforderlichen Verdünnermenge 2. Zusatz des Verdünners bei Raumtemperatur 3.Wartezeit von 10 Minuten 4.Kontrolle der Motilität 5.Abfüllen und Kennzeichnen der Besamungsdosis 6.Überführen in den Kühlschrank und Lagerung bei 5°C

Verdünnung (Beispiel: Tiefgefrierkonservierung Bulle) - Abkühlung in mehreren Schritten - Zugabe von Verdünner bei Raumtemperatur - schrittweise Absenkung auf -196°C - computergesteuerte Temperaturabsenkung - tierartliche Besonderheiten

Konfektionierung - Handhabung (Lagerung, Schutz, Identifikation, kryobiologische Aspekte) Konfektionierung für die Flüssigkonservierung - Kunststoffgefäße mit starrer Wand (z.B.: Spritzen) - Kunststoffgefäße mit flexibler Wand (z.B.: Tuben) Konfektionierung für die Tiefgefrierkonservierung - Pellets (historisch) - Ampullen (historisch) - Pailletten

Aus: Busch et al., 1993

Pailletten - Entwicklung aus Frankreich, die sich seit den sechziger Jahren weltweit verbreitet hat. - Polyvinylchlorid, verschiedene Farben - Andere Bezeichnung: Straws - Verschiedene Größen: - große Pailletten (Makrotübs): Länge 240 mm; 5 mm, Inhalt 4 ml - mittlere Pailletten: Länge 133 mm; 2,9 mm, Inhalt 0,5 ml - feine Pailletten:Länge 133 mm; 2 mm, Inhalt 0,25 ml - Modell Minitüb:Länge 65 mm; 3 mm, Inhalt 0,25 ml Vorteile der Miniaturisierung: - rationelle Lagerung - Veränderung des Verhältnisses von Oberfläche zu Inhalt Nachteile der Miniaturisierung: - bei einigen Tieren müssen mehrere Pailletten eine Besamungsportion ergeben

Grundaufbau Pailletten Baumwollstopfen mit Polyvinylalkohol- Puder Dient später als Stempel Luftblase Verschluss durch maschinelles Zusammenpressen oder Kugel Hfewhfwefvwejkklllooooo

Grundaufbau Pailletten Luftblase Hfewhfwefvwejkklllooooo

Grundaufbau Pailletten Hfewhfwefvwejkklllooooo

Grundaufbau Pailletten Hfewhfwefvwejkklllooooo

Grundaufbau Pailletten Hfewhfwefvwejkklllooooo Angaben auf der Besamungsportion - Identitätsnummer - Kurzname (Rasse) - Datum der Spermaentnahme - (Name) und Code der Besamungsstation Sinn: - Identitätsnachweis der Nachkommen - Rückverfolgung (Seuchenhygiene, Erbhygiene)

Lagerung des Tiefgefriersperma - im flüssigen Stickstoff (N 2 ) - Temperatur -196 Grad Celsius - Eigenschaften:- farblos - geruchlos - chemisch nicht aggressiv - schwerer als Luft - Siedepunkt: -196 °C Siedetemperatur oder -punkt: Der Siedepunkt stellt die Bedingungen dar, welche beim Phasenübergang eines Stoffes von der flüssigen in die gasförmige Phase vorliegen, was man als Sieden oder Verdampfen bezeichnet.

Luft: Gasgemisch der Erdatmosphäre hauptsächliche Bestandteile: - Stickstoff 78 % - Sauerstoff 21 % - Argon 0,9 % - Kohlenstoffdioxid 0,03 % - Rest

Gefahr durch flüssigen Stickstoff - N 2 muss verdampfen können - Explosionsgefahr bei festen Verschluss - Erstickungsgefahr in verschlossenen Räumen - Erfrierungen - besondere Gefahr: Augenverletzungen Merke: - Container vor Umkippen schützen auch im Auto - Augen schützen (Schutzbrille tragen) - Container nicht in schlecht belüfteten Räumen lagern (Keller, Abseiten, u.a.) - Container müssen regelmäßig aufgefüllt werden

Sollte nicht im Fahrgastraum transportiert werden.

Sofortmassnahmen bei Unfällen mit flüssigen Stickstoff - Kleidung und Schuhe ausziehen, wenn N 2 zwischen Kleidung und Haut - Augen: mit Wasser spülen - Bei Blasenbildung nicht reiben betroffene Stellen mit Verbandsmaterial abdecken - Räume lüften

Lagerungsgefäße für Tiefgefriersperma - Container Isolierung durch - doppelwandiger Behälter - Vakuum + Isoliermaterial Deckel gewährleistet - Schutz - Verdampfung Technische Daten von Containern - Füllmenge - Verdampfungsrate Stickstoffverbrauch muss kontrolliert werden - Messstäbe - Waagen

Lagerungsgefäße für Tiefgefriersperma °C °C °C nahe Umgebungstemperatur Spermaschädigung ab einer Temperatur von °C Wiederholte Exposition führt zur Akkumulation der Schäden

Aus: Busch et al., 1993 Container Kanister Goblet

Reinigung und Desinfektion von Spermacontainern - vorgeschrieben, wird auch kontrolliert (Dokumentation) - Ansammlung von Sediment (Dreck, Spermaportionen) - Infektionserreger werden konserviert Vorgehen - Spülung mit destilliertem Wasser - Begasung wäre ideal (Formaldehyddampf)

Entnahme einer Besamungsportion Prinzip - Nur die Portion entnehmen, die gebraucht wird - Die anderen Portionen nicht schädigen - die entnommene Portion unverzüglich dem Auftauprozess zufügen Vorgehen - Container öffnen – Standplatz des Deckels - Kanister soweit anheben, dass Paillette mit Pinzette erfasst werden kann – obere Kante der Pailletten darf Niveau der Containeröffnung nicht überragen - Paillette kurz schwenken - Kanister absenken - Paillette ins Auftaugerät überführen - Container schließen

Entnahme einer Besamungsportion Vorraussetzungen - Inventarverzeichnis - gute Lichtverhältnisse Fehler - Langes Suchen der richtigen Portion - Zu weites Hochziehen der Kanister - Fecheln mit der Hand

Auftauen einer Besamungsportion Prinzip - schnelles Auftauen verhindert Rekristallisation - kontinuierliche Wärmeübertragung verhindert ungleichmäßiges Auftauen - optimal: 75°C über 5 bis 10 Sekunden - Samenportion darf nicht zu warm werden < 40°C - Die Temperatur darf nur nach oben gehen Schlechte Auftaubedingungen - in der Hand - im Mund - an der Luft (Umgebungstemperatur)

Auftauen einer Besamungsportion Vorgehen - Kontrolle des Auftaugerätes (Betriebstemperatur) - Temperatur des Wasserbades 38 ± 2 °C - Dauer: feine Pailletten: 25 Sekunden mittlere Pailletten und Minitüb: 30 Sekunden - Überführen der Portion in das Auftaugerät - Entnahme der Portion - Identitätskontrolle - Abtrocknen der Portion - Beförderung der Luftblase auf die Verschlussseite - Öffnen der Portion - Einbringen in das Besamungsgerät

Lagerung des flüssigkonservierten Spermas - Eber: ca. 17°C - Rüde: ca. 5°C - Hengst: 4 - 6°C - Kühlkette muss eingehalten werden – auch kurzfristige Erwärmung verhindern - Lagerung im Kühlschrank