Vorlesung: Fortpflanzung Wintersemester 2006/7, 5. Fachsemester - Follikulogenese, Ovulation, Oogenese, IVM und IVF, frühembryomale Entwicklung Das Leben kommt auf alle Fälle aus einer Zelle. Doch manchmal endet´s auch bei Strolchen in einer solchen. Heinz Erhardt

Follikulogenese Wachstum und Differenzierung von Follikeln 1.Einwanderung von Primordialkeimzellen in die Gonadenanlage 2.Primordialfollikeln 3.Primärfollikeln 4.Sekundärfollikeln 5. Tertiärfollikeln - präovulatorischer Tertiärfollikel (Graafscher Follikel) - Zunahme der Granulosazellen - Differenzierung der Granulosazellen - Aufbau der Zona pellucida - Wachstum und Reifung der Eizelle

- Synthese der Follikelflüssigkeit - Formierung der Follikelhöhle

Die Follikelflüssigkeit bildet das Milieu, in dem die Eizelle reift. Steigt Fällt - Glukose- Laktat - ß-HBA- Harnstoff - Cholesterol - Kalium, Chlorid - pH-Wert - Triglyzeride

Harnstoff NEFA Eizellqualität Granulosazell- funktion Die Stoffwechsellage des Individuums beeinflusst die Zusammensetzung der Follikelflüssigkeit – Bedeutung für die Fertilität teilweise noch unklar.

Grundlagen der Follikelentwicklung gonadotropin- unabhängig gonadotropin- abhängig LH-Impuls - kontinuierlicher Übertritt vom Ruhepool in die Wachstumsphase - Selektionsprozess führt zur Dominanz - Entwicklung des Tertiärfollikels dauert mehrere Wochen Endphase bis zur Ovulation nur wenige Tage

Grundlagen der Follikelentwicklung Die maximale Zahl der Follikel ist vor der Geburt festgelegt. Je älter das Muttertier wird, desto älter sind die Follikel.

Follikelreifung während des Zyklus -mehrere Follikel beginnen zu wachsen (Kohorte) -mit zunehmendem Follikeldurchmesser nimmt die Östrogensynthese zu. Dies wirkt negativ rückkoppelnd auf die LH- und FSH–Ausschüttung (negatives Feedback, tierartliche Unterschiede) -zusätzlich Wirkung von Inhibin aus dem Follikel -Durch die fallende FSH-Konzentration beginnen kleinere Follikel zu atresieren - Kampf um das FSH -Die steigenden Östrogenkonzentrationen führen zu einer Umschaltung vom negativem auf ein positives Feedback -Östrogene bewirken eine schlagartige Freisetzung von LH/(FSH) -LH-Peak wirkt als ovulationsauslösendes Signal

Präovulatorischer LH-Anstieg Hypothalamus Follikelwachstum Glandotrope Zellen des Hypophysenvorderlappen: erhöhte GnRH-Rezeptor-Expression Sensibilisierung der GnRH-Rezeptoren Wechsel von LH-Speicherung zu LH-Freisetzung veränderte LH-Glykosilierung Steigerung der Östrogensynthese + + LH-Ausschüttung mit hoher biologischer Aktivität Ovulation

Induzierte Ovulation -auslösender Reiz ist der Paarungsakt - Rezeptoren in der Vagina führen zur Ausschüttung von gonadotropen Hormonen Katze: - LH - für multiple Ovulationen sind wiederholte Bedeckungen notwendig Andere Beispiele: Kaninchen, Frettchen, Kameliden

Tierartliche Unterschiede Follikelwachstum bis zur präovulatorischen Größe im Interöstrus möglich bei Rind, Pferd, Schaf und Ziege Praktische Konsequenz? Ovulation Follikeldurchmesser Zyklus

Tierartliche Unterschiede Follikelwachstum im Interöstrus nur beschränkt möglich bei Schwein, Ratte und Primaten Praktische Konsequenz? Ovulation Follikeldurchmesser Zyklus

Ovulation nur möglich wenn Progesteron Ovulation Follikeldurchmesser Zyklus

- Luteolyse: Fehlt das Signal des Embryos kommt es zum Abbau des Gelbkörpers Das endogene Luteolysin ist endometriales PGF 2 Ovulation Follikeldurchmesser Zyklus

Luteolyse beim Wiederkäuer Östrogene induzieren die Synthese von Oxytozinrezeptoren im Endometrium Oxytozin aus dem Gelbkörper bindet an die Endometriumrezeptoren Induktion der Prostaglandinsynthese im Endometrium Luteolyse Oxytozin stellt einen wesentlichen Faktor für die Luteolyse beim Wiederkäuer dar

Ovulation -Freisetzung der Eizelle und der sie umgebenden somatischen Zellen aus dem Follikel -Endokrines Signal ist der LH-Peak -Follikelwand reißt ein (unter Vermittlung verschiedener Entzündungsmediatoren: z. B.: Prostaglandine) -Die Granulosa- und Thekazellen differenzieren zu Luteinzellen. -Die Luteinzellen synthetisieren Progesteron. -Teilweise präovulatorische Luteinisierung (vgl. Deckzeitpunktbestimmung Hündin)

20 Std. vor der Ovulation 6 Std. vor der Ovulation Strukturelle Follikelwandveränderungen gehen der Ovulation voraus. Der Follikel springt nicht, er fliesst aus.

Prinzipien der Oogenese - Reduktion des diploiden auf den haploiden Chromosomensatz 2n zu n - Neukombination der maternalen und paternalen Erbsubstanz Meiose - Erlangung der Befruchtung- und Entwicklungskompetenz - Beginn der Meiose in der Fetalperiode - 1. meiotische Arretierung in der 1. Prophase (meist vor der Geburt oder wenig später) - Wachstumsphase - Wiederaufnahme der Meiose - 2. meiotische Arretierung in der Metaphase 2

LH-Peak Elektrische Stimulation Chemikalien Ovulation: Eizelle im 2. meiotischen Arrest (Metaphase 2, außer Caniden) Beendigung der Meiose nach erneuter Aktivierung Isolation aus dem Follikel Eizelle im 1. meiotischen Arrest Spermium Elektrische Stimulation Chemikalien

Zeitlicher Ablauf der Meiose nach LH-Peak in Stunden TierartLatenzphaseMetaphase 2 (Ovulationsstadium) Rind Schaf Schwein

Oogenese

Eizellreifung oder Maturation Primordialkeimzelle Fetus Post natum Oogonie Oozyte Wachstumsphase Ovulation Zygote Beendigung der Meiose Eintritt in die Meiose 1. Arretierung 2. Arretierung Gonadotropinimpuls Zwischen der 1. meiotischen Arretierung und der Wiederaufnahme der Meiose erlangt die Eizelle ihre meiotische Kompetenz.

Eizellreifung oder Maturation - induziert durch den präovulatorischen LH-Peak - Die Eizelle erlangt ihre Befruchtungs- und Entwicklungskompetenz Kernreifung zytoplasmatische Reifung

Kernreifung Zytoplasmareifung Auflösung der Kernmembran Aufbau des Spindelapparates Chromosomenkondensation Umorganisation von Zellorganellen Zunahme von Lipidtropfen Aktivierung spezifischer Enzyme (MAPK, MPF) Kernreifung Zytoplasmareifung Auflösung der Kernmembran Aufbau des Spindelapparates Chromosomenkondensation Umorganisation von Zellorganellen Zunahme von Lipidtropfen Aktivierung spezifischer Enzyme (MAPK, MPF) MPF MAPK

Abbildung einer ovulierten Eizelle 1. Eizellkern (Germinalvesikel) 7. Mikrovilli 2. Speichervesikel8. Zona pellucida 3. Mitochondrien Corona radiata 4. Golgifeld 5. Kortikalgranula 6. Lipidtropfen

Zona pellucida - extrazelluläre Matrix, welche die Eizelle umgibt - aufgebaut aus Glykoproteinen - löst sich tierartlich unterschiedlich zwischen dem 6. und 12. Tag nach der Befruchtung auf Funktion: - Gameteninteraktion (Gametenerkennung, Auslösung der Akrosomenreaktion) - zonaler Polyspermieblock - Schutz der Eizelle - Schutz des jungen Embryos

In-vitro-Maturation (IVM) - Verlegung der Vorgänge der Eizellmaturation in die Kultur - Folgende Schritte: - Gewinnung von Eizellen - Kultivierung von Eizellen - nach geschaltete Prozesse (z. B. In-vitro-Fertilisation) In-vitro-Maturation (IVM) In-vitro-Kapazitation In-vitro-Fertilisation (IVF) In-vitro-Embryonen

In-vitro-Maturation (IVM) - Gewinnung von Eizellen - selektiv - Stimulation von Donatoren - Punktion einzelner Follikel (Laparotomie, Ovum-Pick-up) Vorteil: Abschnitte der Reifung erfolgen in vivo, daher bessere Entwicklungskompetenz Nachteil: aufwendig, teuer - unselektiv - Sammeln von Ovarien auf dem Schlachthof - Punktion einzelner Follikel oder Splicen Vorteil: kostengünstig, viel Material Nachteil: niedrigere Entwicklungskompetenz

In-vitro-Maturation (IVM) - Gewinnung von Eizellen Kumulus-Oozyten-Komplex

In-vitro-Maturation (IVM) – Kultivierung von Eizellen Kultivierung als Kumulus-Oozyten- Komplex Komplexe Medien mit Zusatz von fetalem Kälberserum Hormonzusätze meist LH, FSH, Östradiol Labor- bzw. Arbeitsgruppen- spezifische Zusätze z.B.: östrisches Kuhserum Hormoneller Stimulus auf die somatischen Zellen

Effizienz der In-vitro-Befruchtung von in vitro gereiften Rinderoozyten % von 100 kultivierten Eizellen Effizienz (%) Eizellreifung80 Spermienpenetration6480 Ausbildung von 2 Vorkernen 5180 Entwicklung bis zur Morula/Blastozyste 1530 Gravidität nach Transfer 960 Geborene Kälber780 Aus: Niemann, Meinecke, 1994

Probleme der IVM/IVF - noch nicht ausgereifte Kultivierungsbedingungen für die Eizellen - noch nicht ausgereifte Kultivierungsbedingungen für die frühen Embryonen - große Variationen in der In-vitro-Befruchtungspotenz unterschiedlicher Vatertiere Bisher wurden Nachkommen von verschiedenen Tierarten über IVM/IVF generiert. Die meisten Erfahrungen liegen vom Rind und Schaf vor. Beim Schwein ergeben sich unter anderem aufgrund der hohen Polyspermierate Probleme in der Anwendung.

Large-calf-syndrome besser Large-offspring-syndrom Definition Erscheinung, dass Nachkommen, die aus In-vitro-Techniken stammen, häufig deutlich größer sind, als Individuen, die ohne manipulative Massnahmen generiert wurden. Folgen - verlängerte Trächtigkeit - erhöhte Dystokierate - erhöhte neonatale Morbidität und Mortalität Ursachen - Unterschiede im zeitlichen Genexpressionsmotiv ?

Vorgänge vor der Befruchtung - Position von Spermien im Genitale (Bedeckung, Besamung) - Spermientransport - Spermienkapazitation - Gameteninteraktion (Spermatozoon-Eizell-Interaktion) - Gametenfusion - Poylspermieblock - Vorkernbildung - Zygotenbildung Vorlesung Andrologie

Gameteninteraktion (Spermatozoon-Eizell-Interaktion) - Ein kapazitiertes Spermium bindet an die Zona pellucida (primäre Bindung, Protein-Kohlenhydrat-Bindung) - Die Bindung löst die Akrosomenreaktion aus: - Exostose von Enzymen aus dem Akrosom - Herausbildung einer fusinogenen Region im Bereich des Äquartorialsegmentes - Sekundäre Bindung - Enzymatische Proteolyse in Verbindung mit der Motilität des Spermiums führen zur Penetration der Zona pellucida fusinogene Region

Akrosomenreaktion

Gametenfusion - Das Spermium gelangt in den perivitellinen Raum und lagert sich seitlich an die Eizelle - Das Spermium wird in die Eizelle aufgenommen. - Die Fusion führt zu einer periodischen Depolarisation der Eizellmembran – Fusionsblock für weitere Spermien - Überwindung der 2. meiotischen Arretierung der Eizelle, Beendigung der Meiose, Abschnürung des 2. Polkörperchens

Polyspermieblock - Schneller Polyspermieblock: Depolarisation der Eizellplasmamenbran - Langsamer Polyspermieblock: Depolarisation führt zur Exocytose der kortikalen Granula in den perivitellinen Raum. Dies bewirkt eine strukturelle Veränderung der Zona pellucida – Zonablock.

Frühe embryonale Entwicklung - Blastozytenformation: - äußere Zellen - Trophoblast - Embryoblast - inner cell mass, Embryonalknoten - Ektoderm, Mesoderm, Endoderm - Zona-Schlupf - Elongation Nach dem Schlupf aus der Zona kommt es zum massiven Größenwachstum bei Schaf und Schwein (11. Tag) und Kuh (Tag 13). Schwein: 2 mm sphäroid am 10. Tag 10 mm tubulär am 11. – 12. Tag

Frühe embryonale Entwicklung - intrauterine Migration -Implantation - Plazentation

Der Eileiter ist der Ort - der Befruchtung - der frühembryonalen Entwicklung - an dem Transport der Gameten und des Embryos stattfindet - der an der Regulation der Spermienfreisetzung beteiligt ist Erkrankungen des Eileiters können zur Sub- und Infertilität führen.