学生 : 袁 秋 华 学生 : 袁 秋 华 导师 : 顾蕴洁教授 导师 : 顾蕴洁教授 王 忠教授 王 忠教授 小麦 Rubisco 单克隆 抗体的制备

 Rubisco 首先由 Wildman 和 Bonner 于 1947 年从菠菜 叶中作为一种可溶性大分子蛋白质被发现，当时称 为 “ 分部 I 蛋白（ fraction I protein” ）。后来碳同 化研究发现分部 I 蛋白就是催化光合作用中 co 2 固定 的 RuBp 羧化酶。  1971 年发现 RuBp 羧化酶是一个双功能酶，它还能 催化 RuBp 的氧化作用。此后该酶就被称为核酮糖 二磷酸羧化酶 / 加氧酶，简称 Rubisco 。 Rubisco 的发 现

Rubisco 的结构 所有真核和大多数原核的光合有机体中的 Rubisco 由 8 个大亚基和 8 个小亚基组成，大亚基一般由 475 个氨基酸 残基组成，不同来源的 Rubisco 大亚基序列有 80% 以上的 同源性，而且特别是在 169—220 和 321—340 之间的氨基 酸残基序列，在不同有机体中几乎完全一致，现在已知 这些区域含有与催化及活化过程有关的氨基酸残基。 大多数 Rubisco 小亚基由 123 个氨基酸残基组成，不同 植物间小亚基氨基酸序列的同源性比大亚基低得多，一 般在 70% 左右，然而，小亚基序列中有两个区域非常保 守，即残基 10—21 和 61—67 ，暗示这些部分可能有什么 重要功能。

Rubisco 的结构图

核酮糖 -1 ， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶（简称 Rubisco ）催 化卡尔文循环中最初的 CO 2 固定，使核酮糖 -1 ， 5- 二磷酸 （ RuBp ）与 CO 2 形成两分子 3- 磷酸甘油酸。该酶也同时 催化光呼吸作用中的第一个步骤，使 RuBp 与 O 2 反应产生 一分子磷酸甘油酸和一分子磷酸乙醇酸。因此 Rubisco 处 于光合碳还原和光合碳氧化两个方向相反但又相互连锁 的循环的交叉点上，它对净光合速率起着决定性的影响。 Rubisco 的功 能

Rubisco 的纯化

Rubisco 的纯度鉴定 利用 ND-PAGE 和 SDS-PAGE 鉴定 Rubisco 纯度。

Rubisco 的纯度鉴定结果 Rubisco 的非解离聚丙烯 酰胺凝胶电泳结果 Rubisco 的 SDS- 聚丙 烯酰胺凝胶电泳结果 大亚基 小亚基 Rubisco 标准蛋白 分子量 （ ×1000 ）

我们得到高纯度的 Rubisco 后，就 可以制备其单克隆抗体了，下面 先跟大家介绍一下单克隆抗体制 备的技术。

抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性 结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并 采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其 他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗 原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体 也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针 对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同 B 细胞 克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称 多克隆抗体（ polyclonal antibody ），简称多抗。由于 常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量 差异很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。 因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限 量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着 杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 单克隆抗体产生的背景

1975 年， Kohler 和 Milstein 大胆地把丧失合成次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸 核糖转移酶（ hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase ， HGPRT ）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融 合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤 （ hypoxanthine ， H ）、氨基喋呤（ aminopterin ， A ）和胸腺嘧啶 核苷（ thymidine ， T ）的培养基（ HAT ）中生长进行选择。在融合 后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是 HGPRT+ ，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合 的 HGPRT- 骨髓瘤细胞和相互融合的 HGPRT- 骨髓瘤细胞不能在 HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因 得到分别来自亲本脾细胞的 HGPRT 和亲本骨髓瘤细胞的连续继代 特性，而在 HAT 培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的 那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞 系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂 交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 单抗制备的原理

单克隆抗体概念 1975 年， Kohler 和 Milstein 建立了淋巴细胞杂交瘤 技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体 外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成 B 细胞 杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像 骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永 生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗 体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆 系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗 原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体 （ monoclonal antibody ），简称单抗。

单抗与多抗的比较 优点缺点 单抗 针对单一抗原 纯度高 专一性强 重复性好 能持续地无限量体外繁殖 获得高效价的单抗往往需要 耗费较多的人力物力与时间， 因此其价格也较高, 适应性窄 多抗 识别的适应性宽， 制备价格相对较低 针对多个抗原 纯度不高 专一性不强 重复性较好 每次都要从动物血清中提取

杂交瘤细胞的筛选 方法： 方法： 1 、免疫酶技术 2 、免疫荧光技术 2 、免疫荧光技术 3 、间接血凝试验 3 、间接血凝试验 4 、放射免疫测定 4 、放射免疫测定 免疫酶技术是将抗原抗体反 应的特异性和酶对底物显色 反应的高效催化作用有机结 合而成的免疫学技术。由于 它特异性高，灵敏度高，现 已广泛用于筛选和鉴定单抗。 间接血凝试验又称被动血凝 试验（ PHA ），是目前应用 较广的检测方法之一。本试 验是以包被可溶性抗原的红 细胞作为指示系统，当被检 抗体与包被在红细胞上的抗 原产生特异性反应时，导致 红细胞凝集现象。可见，该 法具有灵敏、快速、容易操 作和无需昂贵仪器等优点， 而且经改用醛化红细胞以后， 克服原来重复性差的缺点。 放射免疫测定是用放射性同 位素标记抗原或抗体，以检 测相应抗原或抗体的定量方 法。在筛选和鉴定单抗时常 用抗原固相法，即用抗原包 被聚乙烯微板，借以检测样 品中的 McAb

包 被 洗 涤 封 闭 洗 涤 加一抗 用碳酸盐 Buffer 将两酶抗原稀 释到所需浓度，每孔加入 100μL ， 4 ℃包被过夜。 每孔加入保温液 200μL ， 37 ℃ 孵育 3h （或 4 ℃过夜）。 每孔加入经稀释液稀释的待 测抗血清样品 100μL ，同时设 立阴性对照， 37 ℃孵育 2h 。 单抗检测 （间接 ELISA ） 用 PBST 洗涤 3 次，每次洗 浸泡 5 分钟后拍干。

结果判定 洗 涤 终 止 显 色 洗 涤 加 二 抗加 二 抗 每孔加入稀释至工 作浓度的羊抗鼠 IgG 二抗 100μL ， 37 ℃孵育 2h 。 每孔加入 OPD 底 物溶液 100μL ， 37 ℃避光反应 15min 左右。 在 490nm 波长下测定样 品的 OD 值，结果以 P ／ N 比值表示，即将样品 的 OD 值与阴性样品 OD 值的均值相比，若大于 1.5 倍，即判为阳性。 用 2mol/L 的硫酸 溶液终止。

杂交瘤细胞的克隆化 a 、制备小鼠腹腔细胞。同 “ 细胞融合 ” 一节 中的方法。 b 、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含 20% 血清的 HT 培养基稀释至每毫升含 2.5 、 15 和 50 个细胞 3 中不同的稀释度。 c 、按每毫升加入 5×104-1×105 细胞的比例， 在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬 细胞。 d 、每种杂交瘤细胞分装 96 孔板一块，每个 稀释度 32 孔，每孔量为 0.2ml ，每孔的杂交瘤 细胞数分别为 0.5 、 3 和 10 。 e 、 37 ℃、 7.5% CO2 湿润培养 7-10 天，出现 肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微 镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取 上清作抗体检测。 f 、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并 冻存。 （ 1 ）有限稀释法 （ 2 ）软琼脂法 a 、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞） 单层。 b 、临用前将 2.0% 琼脂糖生理盐水溶液与等 量双倍浓度的 HT 培养基混匀，配成 1% 琼脂 糖培养液， 45 ℃水浴中温育。 c 、吸去平皿上层培养液，加入 1% 琼脂糖培 养液 3ml ，室温 10 分钟。 d 、取杂交瘤细胞悬液 1ml ，加入 1% 琼脂糖培 养液 1ml 混匀，铺于上层。 e 、 37 ℃、 7.5% 湿润培养 7-14 天；克隆生长至 2mm 时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于 含有饲养细胞的 24 孔板，扩大培养。 f 、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆 化，或扩大培养、冻存。

单抗的大规模制备 （ 1 ）动物体内生产单抗 （ 3 ）杂交瘤细胞的无血清培养 （ 2 ）体外培养生产单抗

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