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12. Arbeitstagung 12. Arbeitstagung Martinsried 18.-20. Juli 2005 Contest Proteomanalyse von 10.000 Zellen
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12. Arbeitstagung Analyse eines Zellpellets aus 10.000 Zellen Zellen wurden gezählt und mit PBS-Puffer auf eine Konzentration von 10.000 Zellen pro 10 µl eingestellt. Zellen wurden aliquotiert und in der SpeedVac eingeengt. Menschliche Zellinie aus embryonalen Nierengewebe HEK 293 Zellen wurden unter Standardbedingungen kultiviert. Zellen wurden bei 4°C geerntet und 3 mal mit PBS- Puffer gewaschen
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12. Arbeitstagung Reproduzierbarkeit der Aliquotierung der Pellets von 10.000 Zellen Reproduzierbarkeit der Erzeugung der Zellpellets wurde mittels SDS-PAGE überprüft 1 2 3 4 5 6 7 1 Marker 2-7 Pellets von 10.000 Zellen
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12. Arbeitstagung Optimierung der Verdaubedingungen Für die Optimierung des Verdaus wurden verschiedene Bedingungen getestet Ansätze wurden mittels SDS- PAGE verglichen Marker A Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall/Benzonase -/+ Trypsin B Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall -/+Trypsin C Phosphat-Puffer /CHAPS/95°C/Benzonase -/+ Trypsin D Phosphat-Puffer/CHAPS/ 95° -/+Trypsin E 1 M Harnstoff-Puffer/CHAPS -/+ Trypsin Bedingungen: A B C D E - + - + - + - + - +
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12. Arbeitstagung Herstellung des Verdaus von 10.000 Zellen Ausgangsmaterial: Zellpellet aus 2 Millionen Zellen In 20 µl Lysis-Puffer (TrisHCl 30 mM; Thioharnstoff 2M; Harnstoff 7 M; CHAPS 4 %) aufgenommen 6 x 10 Sekunden Ultraschall lysiert 1:10 verdünnt mit 10 mM NH 4 HCO 3 -Puffer 100 µl Trypsinlösung (0,06 µg/µl) zugegeben Inkubation über Nacht Volumen auf 2 ml gebracht (Wasser) In 10 µl Aliquots aufgeteilt; entsprechend 10.000 Zellen Aliquots in der SpeedVac eingeengt
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12. Arbeitstagung Reproduzierbarkeit der einzelnen Contest-Aliquots Basepeak- Chromatogramme von vier Contest-Verdau Proben LCQ classic Säule: C18; Ø 75 µm x 25 cm Gradient Ameisensäure, 90 min
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12. Arbeitstagung 2D-PAGE von 10.000 Zellen, 2 µg Protein, Cy3-markiert (40 cm x 30 cm) 3.100 Proteinspots
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12. Arbeitstagung VerdauPellet Methode Such- maschine Datenbank Agilent Technologies 3 Läufe 1D-LC-MS/MS (HPLC-Chip/MS XCT Ultra) Spectrum Mill (A03.01.03 7a) IPI.human.v 306 Applied Biosystems 2 Läufe LC MALDI – MS/MS (4800 TOF/TOF Analyzer) 1 Lauf LC-MS/MS (MIDAS; 4000QTRAP) MASCOTCDS Bruker Daltonics 1 Lauf LC-ESI-IT MS (HCT) 1 Lauf LC-MALDI- MS/MS (Ultraflex) 2 Läufe LC- MALDI-MS/MS (Ultraflex) MASCOT (v2.1.0) Swissprot (21.06.2005) GE Healthcare 3 Läufe 1D-LC-MS/MS (LTQ) 3 Läufe 2D-LC- MS/MS (LTQ) SequestNCBI Protana Inc. 3 Läufe LC-MS/MS ( LTQ, "Proteome Reactor“) 3 Läufe LC- MS/MS ( LTQ, "Proteome Reactor“) MASCOT (v2.1.0) NCBI (June 2005) Thermo Electron 3 Läufe LC-MS/MS (LTQ) Turbo-Se- quest v27 (rev.13) NCBI (Mai 2005) Contest-Teilnehmer
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12. Arbeitstagung Insgesamt 1757 nicht-homologe Sequenzen Übereinstimmung (Homologiecluster) der identifizierten Proteine zwischen den Contest-Teilnehmer 52 +64 +110 +171 +251 1109 Nature Methods Vol. 2,9, Sept. 2005, 647-48
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12. Arbeitstagung How to deal with data & results performing high-throughput proteomics Experiments – irrespective of their size and effort and of the amount of the acquired data - have to be repeated independently several times to demonstrate their reproducibilty to get significant results This will remove most of the „1hit wonders“ One-time experiments can not elucidate quantitative differences in two different proteomes, therefore, they should not be named quantitative! We have to go back to scientifically sound experimental work & strategies to create value(s) for ourself and for the society who gives us the money and deserves that we do our best.
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12. Arbeitstagung Anja Tatzel - Biochemiestudentin Christian Stephan - Bioinformatik Christian Scheer –Protagen, Bioinformatik Christian Bunse – LC-MS/MS Oliver von End – Nierenzellen Kai Stühler Danksagung
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