Aktuelle Entwicklungen bei der Gewinnung sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe aus Nebenprodukten der Obst- und Gemüseverarbeitung am Beispiel Traubentrester.

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1 Aktuelle Entwicklungen bei der Gewinnung sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe aus Nebenprodukten der Obst- und Gemüseverarbeitung am Beispiel Traubentrester Dietmar R. Kammerer, Thorsten Maier, Andreas Schieber, Reinhold Carle Universität Hohenheim Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie Lehrstuhl Lebensmittel pflanzlicher Herkunft Stuttgart

2 Nebenprodukte der Obst- und Gemüseverarbeitung
Zunehmend restriktive Gesetzgebung auf EU-Ebene Integrated Pollution Prevention and Control Directive 96/61/EC Landfill Directive /61/EC Animal By-products Regulation /2002 Incineration of Waste /76/EC Gemäß Bio-Abfallverordnung ist das Ausbringen von Trester auf Dauergrünland-flächen seit verboten. Ökonomische Motive für die Reststoffverwertung Hohe Kosten für Entsorgung (´polluter pays´-Prinzip) Verbrauchererwartung (nachhaltige Produktion) Möglichkeiten der Wertschöpfung

3 Nebenprodukte der Obst- und Gemüseverarbeitung
Hoher Wassergehalt der Nebenprodukte aus der Verarbeitung pflanzlicher Lebensmittel Rascher mikrobieller Verderb Abfallprodukte, die aus Fermentationsprozessen stammen Fermentation läuft in den Nebenprodukten weiterhin ab Endogene Enzymaktivitäten (z.B. Polyphenoloxidasen, Peroxidasen) Oxidativer Verlust phenolischer Antioxidantien ► Direkte Weiterverarbeitung oder kostenintensive Trocknung nötig Lagerungs- und Trocknungsbedingungen beeinflussen die Poly-phenolausbeuten und die antioxidative Aktivität signifikant

4 Konventionelle Polyphenolextraktion
Verwendung organischer Solventien, insbes. von Alkoholen oder wässrig-alkoholischen Lösungen Entflammbarkeit Hohe Kosten für Lösungsmittel Regulatorische Erfordernisse Extraktion unter Verwendung von Sulfit, insbes. von Anthocyanen Gesundheitliche Bedenken (allergenes Potential)

5 Konventionelle Polyphenolextraktion
Reversible Bildung von Sulfonsäureaddukten HSO3- ∆T

6 Allergen-Kennzeichnungsverordnung (i.d.F. vom 09.10.2006, Anlage 3)
Zutaten, die allergische oder andere Unverträglichkeitsreaktionen aus-lösen können: Schwefeldioxid und Sulfite in einer Konzentration von mehr als 10 mg/kg oder 10 mg/L, als SO2 angegeben

7 Traditionelle vs. neuartige Extraktionsmethoden
Hauptsächliche Nachteile traditioneller Extraktionsverfahren: Zeitaufwendig Arbeitsaufwendig Geringe Selektivität und / oder geringe Extraktionsausbeuten Verwendung großer Mengen toxischer Solventien Herrero et al., 2006 Vorteile der neuartigen Verfahren: Höhere Selektivität Kürzere Extraktionsdauer Keine Verwendung toxischer organischer Solventien Umweltfreundlich / keine Umweltgefährdung

8 Struktur der pflanzlichen Zellwand Primärwand pflanzlicher Zellen
Polysaccharide 20 – 30 % Cellulose 25 – 30 % Hemicellulosen (Xylane, Glucane, Mannane) 15 – 30 % Pektin (Polygalacturonsäure, Rhamnogalacturonan, Arabinane, Galactane, etc.) Proteine 5 % Glycoproteine, Elastin, Extensin Phenolische Verbindungen < 1 % Lignin Enzyme Peroxidasen, Glucanasen, etc.

9 Struktur der pflanzlichen Zellwand
Cellulose Hemicellulose Pektin Plasmalemma Mittellamelle Primärwand 50 nm Raven et al., 2000

10 Enzymatische Extraktion von Polyphenolen
Hydrolyse der Polysaccharide pflanzlicher Zellwände mittels pektinolyti-scher und cellulolytischer Enzympräparate Erhöhte Gesamtphenolausbeuten aus Traubentrester (Meyer et al., 1998) Verbesserte Extraktion von Anthocyanen und Gesamtphenolen aus Rückständen der Verarbeitung schwarzer Johannisbeeren (Landbo & Meyer, 2001) Generell Zunahme der Extraktionsausbeuten, einige phenolische Komponenten wurden durch Enzymnebenaktivitäten negativ be-einflusst (Kammerer et al., 2005)

11 Flash Release Treatment
Studien wurden mit Trauben durchgeführt, um die Polyphenolextraktion in die Moste und Säfte zu forcieren Schnelle Erhitzung der Trauben auf Temperaturen > 95 °C bei Atmosphärendruck Anschließend anlegen eines starken Vakuums (> 100 mbar) Sofortige Verdampfung Verdampfung induziert Aufbrechen der Zellwände und Abkühlen der Trauben Morel-Salmi et al., 2006

12 Flash Release Treatment
Die Ergebnisse sind bestimmt durch die Kombination thermischer Effekte mit dem Aufbrechen der Zellwände beim Aufheben des Vakuums Inaktivierung qualitätsmindernder Enzyme Verbesserte Solubilisierung aller Klassen phenolischer Verbin-dungen Verändertes Profil einiger Polyphenolklassen, z.B. der Pro-cyanidine Morel-Salmi et al., 2006

13 Supercritical Fluid Extraction (SFE)
fest flüssig gasförmig Überkritisches Fluid Druck Temperatur pc Tc Typisches Phasendiagramm eines Reinstoffes

14 Supercritical Fluid Extraction (SFE)
SFE für die Extraktion von Nebenprodukten der Lebensmittelindustrie Traubenkerne: Polyphenolausbeuten mit überkritischem CO2 und Methanol als Modifier sind höher im Vergleich zur konventionellen Fest-Flüssig-Extraktion (Palma & Taylor, 1999) Fraktionierung phenolischer Verbindungen ist möglich (Murga et al., 2000) Traubenhäute / Traubentrester: Extrakte werden erhalten, die bestimmte Bioaktivitäten aufweisen, z.B. zytotoxische Effekte auf Tumorzellen (Palenzuela et al., 2004)

15 Subcritical Water Extraction (SWE)
SWE: Extraktion mit heißem Wasser unter erhöhtem Druck Parameter: 100 – 374 °C (Tc) 10 – 60 bar Vorteile: Umweltfreundlich Hohe Extraktionsausbeuten Gezielte Variation der Lösungsmittelpolarität möglich

16 Subcritical Water Extraction (SWE)
Temperatur (°C) 100 200 300 400 Dielektrische Konstante 20 40 60 80 Herrero et al., 2006 Dielektrische Konstante von Wasser

17 Subcritical Water Extraction (SWE)
Herrero et al., 2006 Schematische Darstellung eines SWE-Systems Lösungsmittelreservoir Extraktgefäß Abfallbehälter Extraktionszelle

18 Subcritical Water Extraction (SWE)
Anlage im Labormaßstab für die SWE Lösungsmittelreservoir Extraktionszelle Extraktbehälter Abfallbehälter

19 Pulsed Electric Field Treatment
Zunehmende Beliebtheit als nicht-thermische Prozesstechnologie Sofortige Wirkung auf die Zellmembran und kurze Prozesszeiten Reduktion der mikrobiellen Belastung durch Zerstörung bakterieller Zellmem-branen Rastogi, 2003 Behandlungs-kammer Hochspannungs-quelle Lade-widerstand Schalter Kondensator zur Energiespeicherung

20 Pulsed Electric Field Treatment
Rastogi, 2003 Elektrode - + Schalter Spannungs-quelle Elektrisches Feld (E0) Induzierung eines Transmembranpotentials in einer Zelle, die einem externen elektrischen Feld ausgesetzt wird

21 Pulsed Electric Field Treatment
Anwendung gepulster elektrischer Felder zur Verlängerung der Produkthalt-barkeit Inaktivierung von Mikroorganismen (E. coli, S. typhimurium, S. senftenberg, L. monocytogenes…) Inaktivierung qualitätsmindernder Enzyme (nur begrenzt möglich) Herstellung von Frucht- und Gemüsesäften Apfel (Angersbach & Knorr, 1997; Flaumenbaum, 1986; McLellan et al., 1991; Schilling et al., im Druck) Karotte (Knorr et al., 1994) Zuckerrübe (Eshtiaghi & Knorr, 2000) Kokosnuss (Ade-Omowaye et al., 2001)

22 Pulsed Electric Field Treatment
Extraktion pflanzlicher Sekundärmetabolite aus Zellkulturen (Knorr et al., 1994; Dornenburg & Knorr, 1993) Extraktion von Pflanzenphenolen aus Abfallprodukten der Obst- und Gemüse-verarbeitung? Pulsed electric fields for the recovery of pigments from wastes of the food industry (F. De Vito, F. Donsì, G. Ferrari; Università degli Studi di Salerno, Italy) 2006 EFFoST Annual Meeting / Total Food 2006 Sustainability of the Agri-Food Chain The Hague, The Netherlands, 7-9 November 2006

23 Membrantrennverfahren
Ultrafiltration als Mittel zur Aufreinigung von Rohextrakten Entfernung hochmolekularer Zellwandbestandteile (Pektine, Cellulose und Hemicellulosen sowie deren Abbauprodukte) Entfernung von Proteinen Fraktionierung phenolischer Verbindungen nach ihrem Molekulargewicht Niedermolekulare Phenole vs. hochmolekulare Tannine Fraktionen, die unterschiedliche techno- und biofunktionelle Eigen- schaften aufweisen

24 Adsorbertechnologie Adsorbertechnologie als Verfahren zur Gewinnung phenolischer Verbindungen 1. Adsorption der Polyphenole 3. Gewinnung der phenolischen Verbindungen 2. Entfernung nicht-phenolischer Komponenten 4. Regenerierung des Harzes

25 Kommerzielle Anwendung der Adsorbertechnologie
Entbitterung von Zitrussäften (Kimball & Norman, 1990; Shaw & Buslig, 1986) Entfärbung, Standardisierung und Stabilisierung von Saftkonzentraten (Lyndon, 1996) Entfärbung von Pektin, das aus Apfeltrester extrahiert wurde, und gleichzeitige Gewinnung von Polyphenolen (Carle et al., 2001; Schieber et al., 2003) Gewinnung natürlicher Farbstoffe oder von bestimmten wertgebenden Substanzen (z.B. Hesperidin) aus Nebenprodukten der Lebensmittelver-arbeitung (Di Mauro et al., 1999, 2000, 2002; Kammerer et al., 2005)

26 High-Speed Counter-current Chromatography (HSCCC)
multilayer coil axis of rotation axis of revolution stationary sun gear planetary gear Schematischer Aufbau eines HSCCC-Systems Ito, 2005

27 High-Speed Counter-current Chromatography (HSCCC)
Trennprinzip der HSCCC Mischungszonen Entmischungszonen Modi: Head – Tail obere Phase = stationäre Phase Tail – Head untere Phase = stationäre Phase Ito, 2005

28 High-Speed Counter-current Chromatography (HSCCC)
HSCCC-System im Labormaßstab Coils

29 Hintergrund

30 Traubentrester als Quelle natürlicher Antioxidantien
Traubentrester weist hohe Gehalte an Polyphenolen auf Phenolgehalte [%] Bemerkungen Stiele 1-4 Shrikhande (2000) Häute Trauben; Folin-Ciocalteu Kerne 5-8 Trester; Lu & Foo (1999) ca phenolische Verbindungen + oligomere Procyanidine Rote Traubenhäute 3,76 Bravo & Saura-Calixto (1998) Weiße Traubenhäute 4,48 Trester; Folin-Ciocalteu „Weiße“ Traubenkerne 5,22 Einsatz phenolischer Verbindungen aus Traubentrester als natürliche Antioxi-dantien in Lebensmitteln möglich (Bonilla et al., 1999) Ausbeute an phenolischen Verbindungen aus Traubentrester kann durch Ein-satz depolymerisierender Enzyme gesteigert werden (Meyer et al., 1998)

31 Polyphenole in Traubentrester
Detektionswellenlänge: 520 nm Delphinidin-3-O- glucosid Cyanidin-3-O- Petunidin-3-O- Paeonidin-3-O- Malvidin-3-O- acetylglucosid cumaroylglucosid Anthocyane

32 Polyphenole in Traubentrester
Phenolcarbonsäuren Detektionswellenlänge: 280 nm Gallussäure HMF Protocatechu- säure Caftarsäure p-Hydroxy- benzoesäure Cutarsäure Vanillinsäure Kaffeesäure Fertarsäure Syringasäure p-Cumarsäure

33 Polyphenole in Traubentrester Flavanole und Stilbene
Detektionswellenlänge: 280 nm Procyanidin B1 B3 Catechin B2 Epicatechin Polydatin Epicatechingallat Resveratrol

34 Polyphenole in Traubentrester
Flavonole Quercetin-3-O-galactosid Quercetin-3-O-glucosid Quercetin-3-O-glucuronid Quercetin-3-O-rhamnosid Isorhamnetin-3-O-glucosid Myricetin Quercetin Kämpferol Isorhamnetin Detektionswellenlänge: 370 nm

35 Enzymatische Tresterextraktion D-Optimaler Versuchsplan
Einflussparameter: pH-Wert Temperatur Enzymdosage (Novoferm 106 / Cellubrix L ; 3 / 1) 7500 -- 6 6000 55 5 4500 50 4 3000 45 3 1500 40 2 35 1 Stufenwerte: Enzymdosage ppm] Temperatur [°C] C B A Faktoren:

36 Enzymatische Tresterextraktion
Phenolcarbonsäuren Anthocyane 3-D-Liniendiagramme Maier et al., 2007

37 Enzymatische Tresterextraktion
50 100 150 200 250 300 350 Caftarsäure Cutarsäure Fertarsäure Gallussäure Protocatechusäure 20 40 60 80 120 140 160 Delphinidin 3-O-glucosid Cyanidin 3-O-glucosid Petunidin 3-O-glucosid Päonidin 3-O-glucosid Malvidin 3-O-glucosid Delphinidin 3-O-acetylglucosid Petunidin 3-O-acetylglucosid Päonidin 3-O-acetylglucosid Malvidin 3-O-acetylglucosid Päonidin 3-O-coumaroylglucosid Malvidin 3-O-coumaroylglucosid Procyanidin B1 Catechin Procyanidin B2 Epicatechin Epicatechin-gallat Quercetin 3-O-galactosid Quercetin 3-O-glucosid C A B Maier et al., 2007

38 Adsorbertechnologie Aufreinigung und Konzentrierung eines ´Cabernet Mitos´-Tresterextraktes Säulenbeladung Elution Alkohol

39 Adsorbertechnologie Kammerer et al., 2004 Aufreinigung und Konzentrierung eines ´Cabernet Mitos´-Tresterextraktes

40 Isolierung phenolischer Verbindungen mittels HSCCC
Trennung von Caftar-, Cutar- und Fertarsäure Trennung strukturell sehr ähnlicher Substanzen hohe Ausbeute geringer Zeitfaktor

41 Isolierung phenolischer Verbindungen mittels HSCCC
Vortrennung Head-to-Tail-Modus Lösungsmittelgemisch: Hexan / Ethylacetat / Methanol / bidest. Wasser / TFA (3 / 7 / 3 / 7 / 0,01; v/v) Flussraten: 0,5 mL/min (t = min) 1,0 mL/min (t = min) Caftarsäure Cutar- / Fertarsäure

42 Isolierung phenolischer Verbindungen mittels HSCCC
Tail-to-Head-Modus Lösungsmittelgemisch: TBME / Butanol / ACN / bidest. Wasser / TFA (2 / 1 / 2 / 5 / 0,01; v/v) Flussrate: 0,5 mL/min Caftarsäure Cutarsäure Fertarsäure

43 Verwertung von Traubentrester
Trester roter und weißer Trauben Tresterrohextrakt Enzymatische Extraktion Sprühtrocknung Fraktionierung mittels HSCCC Adsorption Aufgereinigte Polyphenolfraktionen Getrockneter Rohextrakt Isolierte phenolische Verbindungen

44 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen
Abfallprodukte werden zunehmend zur Gewinnung phenolischer Verbindungen herangezogen Konventionelle Extraktionsmethoden weisen einige Nachteile auf, daher werden alternative Technologien benötigt Mehrere neuartige Technologien stehen heute zur Verfügung, die Effizienz und Rentabilität muss in den meisten Fällen noch bewertet werden Die Bioaktivitäts-geleitete Extraktion pflanzlicher Abfallprodukte oder die Fraktionierung von Rohextrakten ist möglich ► Herstellung maßgeschneiderter Polyphenolpräparate

45 Solveigh Sanzenbacher
Danksagung Achim Claus Sabine Korhummel Solveigh Sanzenbacher Dieses Vorhaben wurde aus Mitteln der industriellen Gemeinschaftsforschung (Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie via AiF) über den Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.V. (FEI) gefördert Projekt AiF BG.