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Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen W. E. Weber Institut für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutz Martin-Luther-Universität Halle-

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Präsentation zum Thema: "Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen W. E. Weber Institut für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutz Martin-Luther-Universität Halle-"—  Präsentation transkript:

1 Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen W. E. Weber Institut für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutz Martin-Luther-Universität Halle- Wittenberg Dahnsdorf, 5. Juni 2003

2 Gliederung 1.Struktur des Forschungsverbundes Gehölze 2.Projektübergreifende Aspekte 3.Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel 4.Vertikaler Genfluss bei Rosen 5.Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln 6.Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

3 Struktur des Forschungsverbundes Spezifische Umweltwirkungen transgener Gehölze Rhizosphäre P4, P5: Pappel Rebarthropoden P6: Rebe Verantwortliche, am Vorsorgeprinzip orientierte Nutzung gentechnisch veränderter Gehölze Vertikaler Gentransfer Sterilitätskonzepte P1: Espe P2: Apfel Auskreuzung P3: Rose

4 P1 Espen und P2 Apfel –Männliche und weibliche Sterilität bzw. Parthenokarpie sollen vertikalen Gentransfer unterdrücken. P3 Rosen –Quantitative Erfassung des vertikalen Gentransfers P4 Pappeln –Bodensanierung durch transgene Pappeln P5 Pappeln –Einfluss von Transgenen auf die Rhizoflora im Labor und Freiland P6 Wein –Direkter und indirekter Effekt von Chitinasen und anderen Enzymen auf Rebarthropoden bei Wein Gehölze, Übersicht über die Projekte

5 Gliederung 1.Struktur des Forschungsverbundes Gehölze 2.Projektübergreifende Aspekte 3.Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel 4.Vertikaler Genfluss bei Rosen 5.Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln 6.Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

6 Gehölze sind durch folgende Besonderheiten gekennzeichnet: mehr- bis vieljährig große Pflanzen langsame Jugendentwicklung bis zur Blüte genetisch vergleichsweise wenig untersucht

7 Der Versuchsansteller ist für viele Jahre standortmäßig festgelegt. Es gibt zahlreiche Wechselbeziehungen zur übrigen Flora und Fauna. Nur eine vergleichsweise kleine Zahl an Pflanzen kann genauer untersucht werden. Ein einmal gewählter Versuchsplan ist kaum noch zu ändern. Partielle Entnahme von Bäumen führt zu Lücken im Versuchsplan mit allen Konsequenzen. Generelle Aspekte mit transgenen Gehölzen

8 Gliederung 1.Struktur des Forschungsverbundes Gehölze 2.Projektübergreifende Aspekte 3.Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Espen und Apfel 4.Vertikaler Genfluss bei Rosen 5.Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln 6.Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

9 Vermeidung von Auskreuzungen bei transgenen Espen –männliche Sterilität => Pollenflug aus der Anlage –weibliche Sterilität => Samenbildung in der Anlage –Zur Vermeidung eines vertikalen Transfers wird beides gebraucht. Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative Erfassung –Prozentsatz falscher Blüten Quantitative Ausprägung würde im Ernstfall aber kritisch zu bewerten sein. P1 Espe - Ziele

10 P1 Espe Projektplan –7 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens vermittelt) und Kontrolle –Jeweils zwei Varianten: ohne und mit rolC-Gen Das rolC-Gen verursacht eine gut erkennbare Wuchsveränderung. –Jeweils 2 Varianten: ohne und mit Konstrukt für Frühblühen –Je Variante 10 transgene Bäume geplant

11 rolC- Gen (A)geringer Wuchs (B) hellgrüne Blattfarbe Eigenschaften rolC-transgener Aspen (links, mitte) im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen (rechts).

12 Versuchsumfang –(7 +1) * 2 * 2 = 32 Varianten = 320 Bäume Kontrolle der transgenen Espen mit PCR –Einbau nur eines Konstruktes wichtig, da mehrere Konstrukte sich gegenseitig beeinflussen könnten –Ermittlung des Insertionsortes Anzucht der Bäume bis zur Blüte Beobachtung über mehrere Perioden P1 Espe

13 Promotor/Zielgen- Kombination Zielgewebe der Expression Verfügbarkeit PTA29-BarnaseTapetumDr. Debener PTA 29-Vst1TapetumDr. Debener ClGPDHC- BarnasePollenDr. Debener ClGPDHC-Vst1PollenDr. Debener PTA29-argETapetumProf. I. Broer Stigma-spez. Promotor-Barnase StigmaDr. Debener DefH9-iaaMStigmaProf. A. Spena Konstrukte

14 Versuchsfragen: –Zeigen die Konstrukte die gewünschte Wirkung? –Ist die Wirkung ausreichend? Vergleiche: –Jeweils mit gegen ohne Konstrukt, sowohl mit als auch ohne rolC-Gen (Einfach- gegen Doppeltransformation) –Verschiedene Konstrukte miteinander P1 Espe

15 Es ist unbekannt, wann und wie intensiv die Espen blühen, es besteht aber die Hoffnung, dass dies in 1-3 Jahren realisierbar ist. Es ist unbekannt, ob die Konstrukte zu ausreichender männlicher oder weiblicher Sterilität führen. Es darf zur Erreichung des Zieles nur ein kleiner Teil falscher Blüten gebildet werden. Wer setzt fest, welcher Anteil tolerierbar ist (etwa 5%) ? P1 Espe – Offene Fragen

16 P1 Espe - Sicherheitsaspekte Wenn die Espen blühen und der Mechanismus nicht mit Sicherheit erfolgt, könnte eine Ausbreitung stattfinden. Dem kann im Projekt dadurch vorgebeugt werden, dass die blühenden Bäume ins Gewächshaus gebracht werden. Nach Ablauf des Versuches wird die Fläche vollständig gerodet.

17 Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen –Alle Konstrukte werden mit derselben Kontrolle verglichen. –Zusätzlich interessiert der Vergleich der Kontrollen untereinander. Stichprobenumfang –kein Problem, da viele Blüten vorhanden Zeitabhängigkeit –Effekt unbekannt –Blüte auch in Folgejahren, aber im Projektzeitraum wohl nicht mehr verfügbar P1 Espe – biometrische Aspekte (1)

18 Quantitative Erfassung der Wirkung Idealfall: 100 %, jeder Abweicher widerlegt die Hypothese Realfall: vorgegebene Frequenz an Abweichern –Ist die Frequenz genotypabhängig? –Welche Verteilung liegt vor (binomial, Poisson, geklumpt) ? –Wie ist die Frequenz zu bewerten? P1 Espe – biometrische Aspekte (2)

19 Übertragung von Resistenzen über Transformation –Feuerbrand –Apfelschorf –Apfelmehltau Verhinderung der Auskreuzung transgener Bäume –männliche Sterilität => kein Pollenflug aus der Anlage –Parthenokarpie => samenlose Früchte Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative Erfassung –Prozentsatz falscher Blüten P2 Apfel - Ziele

20 Projektplan 6 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens vermittelt) und Kontrolle Transformation transgener und nicht transgener Linien der Sorte Pinova in vitro Kontrolle der Transformation –PCR, Southern Blot, ELISA,... Veredlung auf M9 mit Hibernal als Zwischenveredlung P2 Apfel

21 P2 Apfel - Konstrukte Promotor/Zielgen- Kombination Zielgewebe der Expression Zielstellung PTA29-BarnaseTapetumPollensterilität PTA29-Vst1TapetumPollensterilität CIGPDHC-BarnasePollenPollensterilität CIGPDHC-Vst1PollenPollensterilität DefH9-iaaMStigmaParthenokarpie Nin88-Nin88-antisensePollenPollensterilität

22 Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen –Alle Konstrukte werden mit derselben Kontrolle verglichen. –Zusätzlich interessiert der Vergleich der Kontrollen untereinander. –Vergleich transgen gegen nicht transgen Andere Aspekte ähnlich wie bei den Espen (P1) P2 Apfel – biometrische Aspekte

23 Gliederung 1.Struktur des Forschungsverbundes Gehölze 2.Projektübergreifende Aspekte 3.Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel 4.Vertikaler Genfluss bei Rosen 5.Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln 6.Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

24 P3 Rosen - Teilprojekt 1 Auskreuzungsrate bestimmter Rosentypen –Floribundarosen (Heckenzauber) –Teehybriden (Pariser Charme) Erfassung der Polleneintragsrate über selbstinkompatible Fängerpflanzen (diploider Genotyp) in Abhängigkeit von –Abstand: 0, 20 und 200 m –Richtungen: 2-3 –Standorte: Ahrensburg, Groß Lüsewitz Überprüfung der Auskreuzungsrate –an Samen –mittels molekularer Marker

25 P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Versuchsplan) PC Heck F F F F FF F F Versuchskern: 5 Pariser Charm 5 Heckenzauber Mantel: 20 Fängerpflanzen in 20 bzw. 200 m Entfernung: je 5 Fängerpflanzen Merkmale: Zahl der Früchte zu Zahl der Blüten Je Fängerblock max. 20 Samen

26 Früchte pro Blüte Heckenzauber und Pariser Charme als Kontrollen für die selbstinkompatiblen Fängerpflanzen –Vergleich von Anteilen; 2 Orte Samenkeimrate bei Fängerpflanzen –mehrdimensionale Kontingenztafel –Orte, Abstände, Richtungen Herkunft von Samen bei Fängerpflanzen –mehrdimensionale Kontingenztafel –Orte, Abstände, Richtungen sowie Genotypen (Heckenzauber Pariser Charme, andere Quellen) P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Auswertung)

27 P3 Rosen - Teilprojekt 2 Auskreuzungsrate aus Kulturrosen in Wildrosen –Quelle: 2 Rosenzuchtbetriebe –Empfänger: natürlich vorkommende Wildrosen in der Umgebung Versuchsplan –Anzahl Wildrosen unbekannt, daher kein Plan möglich –max. 100 Samen pro gefundener Pflanze –max Samen Auswertung –Anteil Samen auf Wildrosen aus Auskreuzung –Identifizierung über molekulare Marker

28 Gliederung 1.Struktur des Forschungsverbundes Gehölze 2.Projektübergreifende Aspekte 3.Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel 4.Vertikaler Genfluss bei Rosen 5.Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln 6.Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

29 P4 und P5 Pappeln: Ziele Projektplan Freisetzung transgener Pappeln mit dem Ziel der Schwermetallaufnahme zur Entgiftung verseuchter Böden. Hintergrund ist die Überexpression cytosolischer -Glutamylcystein-Synthetase (cyt-ECS) transgener Pappeln. Stabilität des Transgens über mehrere Perioden Erfassung des horizontalen Gentransfers über Mykorrhizen

30 Versuchsumfang –2 Standorte (Mansfelder Land, Ekatarinenburg) –3 Belastungsgrade mit Kupfer –transgene Pappeln und Kontrollen randomisiert in 50*50 m² Parzellen Beobachtungszeitraum –3 Jahre (geplant), jedes Jahr werden einige Bäume zur Untersuchung gerodet und ergeben Lücken. Vergleiche –zwischen Kontrollbäumen und transgenen Bäumen – zwischen Kupferbelastungen –für jeden Standort getrennt P4 Pappeln

31 P4 Pappeln - Versuchsplan geringe Kupferbelastung mittlere Kupferbelastung hohe Kupferbelastung Mansfelder LandEkatarinenburg ( ) keine Fläche gefunden

32 P4 Pappeln – Versuchsplan (Detail) Ausschnitt; schwarz = Kontrolle, rot = transgen Insgesamt 144 = Bäume + 2 Reihen Kontrolle als Mantel

33 Zu Beginn des Versuches –Bodenproben an verschiedenen Stellen Während der Vegetation –3 Probenahmetermine im Abstand von 2 Monaten –Messung der Konzentration an Thiolen (Glutathion und Phytochelatine) in den Blättern (HPLC) –Messung der Expression des gshl Gens (Northern Blot) P4 Pappeln – Analyse des Entgiftungsprozesses (1)

34 Am Ende der Vegetation jedes Jahr –Rodung von 10 Kontroll- und 10 transgenen Bäumen je Parzelle –Chemische Analyse der Biomasse (in Blätter und Holzteile getrennt) auf 10 Schwermetalle –Bodenproben an den Entnahmestellen –Sammeln der Blätter nach Laubfall (vermeidet Wiedereintrag) Am Ende des Versuches –Rodung der Flächen –Verbrennung und Ascheanalyse auf Schwermetalle –Bodenproben an verschiedenen Stellen P4 Pappeln – Analyse des Entgiftungsprozesses (2)

35 P5 Pappeln und Mykorrhizen Schwerpunkte sind: Untersuchung des Einflusses der verstärkten Schwefelaufnahme durch transgene Pappeln auf die Zusammensetzung der für Pappeln wichtigen Mykorrhizen Beeinflussung der Schwefelaufnahme transgener Pappeln durch Mykorrhiza Untersuchungen zum horizontalen Gentransfer (Übertragung von Transgenen von der Pappel auf Mykorrhizen). Hierzu dient der Versuch zur Bodenentgiftung (P4).

36 Mykorrhizisierungsgrad an Stichproben ( Bäume) Anzucht der gefundenen Mykorrhizen und deren Bestimmung der Arten Verschiedene Entnahmezeitpunkte, um Umwelteinflüsse zu erfassen Da horizontaler Gentransfer ausgesprochen selten erwartet wird, ist eine biometrische Analyse kaum möglich. P4 und P5 Pappeln –Mykorrhiza

37 Gliederung 1.Struktur des Forschungsverbundes Gehölze 2.Projektübergreifende Aspekte 3.Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel 4.Vertikaler Genfluss bei Rosen 5.Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln 6.Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

38 A: Laborversuche zum Einfluss von Enzymen und Insektenpathogenen auf Larven von Lobesia botrana (Traubenwickler, Schädling) und Typhlodromus pyri (Raubmilbe, Nützling) B: Gewächshausversuche mit transgenen Reben, die diese Enzyme enthalten C: Freisetzungsversuche mit transgenen Reben P6 Wein – Auswirkung transgener Reben auf Arthropoden als Nichtzielorganismen

39 Enzyme –CHI (Chitinase) –GLU (1,3 Glucanase) –RIP (Ribosom-inhibierendes Protein) Insektenpathogene –Bacillus thuringiensis –Entomopathogene Pilze Erfasste Wirkungen –Direkte Toxizität der Enzyme –Synergistische und antagonistische Wirkungen der Enzyme über die Insektenpathogene P6 Wein – Auswirkung transgener Reben auf Arthropoden als Nichtzielorganismen

40 Toxizität über Probitanalyse –LD50 sowie LD20 und LD80 –Schwellenwerte über Vorversuche Mikroskopische Untersuchungen –Beschaffenheit der Matrix des Mitteldarmes wird an 10 Larven je Stufe analysiert Sequentielle Vorgehensweise –Das Ergebnis der Laborversuche bestimmt das Vorgehen im Gewächshaus, dieses wiederum die Strategie bei den Freilandversuchen P6 Wein – Biometrische Aspekte

41 Zusammenfassung 1.Der Verbund ist vergleichsweise heterogen. 2.Die Dauerhaftigkeit der Gehölze verträgt sich schlecht mit der zeitlich befristeten Projektdauer. 3.Die Möglichkeiten der biometrischen Versuchsplanung sind bei Freilandversuchen und z. T. auch im Gewächshaus stark eingeschränkt. 4.Einige Ereignisse werden nur selten erwartet, der für sichere Aussagen notwendige große Stichprobenumfang ist aber technisch meistes nicht machbar. 5.Im Vordergrund steht der Erkenntnisgewinn, nicht die Sicherheit.


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