Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen

Präsentation zum Thema: "Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen"—  Präsentation transkript:

1 Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen
W. E. Weber Institut für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutz Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Dahnsdorf, 5. Juni 2003

2 Gliederung Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
Projektübergreifende Aspekte Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel Vertikaler Genfluss bei Rosen Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

3 Struktur des Forschungsverbundes
Spezifische Umweltwirkungen transgener Gehölze Vertikaler Gentransfer Rhizosphäre Rebarthropoden Sterilitätskonzepte Rhizosphäre Rebarthropoden P1: Espe P4, P5: Pappel P6: Rebe P2: Apfel Auskreuzung P3: Rose Verantwortliche, am Vorsorgeprinzip orientierte Nutzung gentechnisch veränderter Gehölze

4 Gehölze, Übersicht über die Projekte
P1 Espen und P2 Apfel Männliche und weibliche Sterilität bzw. Parthenokarpie sollen vertikalen Gentransfer unterdrücken. P3 Rosen Quantitative Erfassung des vertikalen Gentransfers P4 Pappeln Bodensanierung durch transgene Pappeln P5 Pappeln Einfluss von Transgenen auf die Rhizoflora im Labor und Freiland P6 Wein Direkter und indirekter Effekt von Chitinasen und anderen Enzymen auf Rebarthropoden bei Wein

5 Gliederung Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
Projektübergreifende Aspekte Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel Vertikaler Genfluss bei Rosen Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

6 Gehölze sind durch folgende Besonderheiten gekennzeichnet:
mehr- bis vieljährig große Pflanzen langsame Jugendentwicklung bis zur Blüte genetisch vergleichsweise wenig untersucht

7 Generelle Aspekte mit transgenen Gehölzen
Der Versuchsansteller ist für viele Jahre standortmäßig festgelegt. Es gibt zahlreiche Wechselbeziehungen zur übrigen Flora und Fauna. Nur eine vergleichsweise kleine Zahl an Pflanzen kann genauer untersucht werden. Ein einmal gewählter Versuchsplan ist kaum noch zu ändern. Partielle Entnahme von Bäumen führt zu Lücken im Versuchsplan mit allen Konsequenzen.

8 Gliederung Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
Projektübergreifende Aspekte Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Espen und Apfel Vertikaler Genfluss bei Rosen Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

9 P1 Espe - Ziele Vermeidung von Auskreuzungen bei transgenen Espen
männliche Sterilität => Pollenflug aus der Anlage weibliche Sterilität => Samenbildung in der Anlage Zur Vermeidung eines vertikalen Transfers wird beides gebraucht. Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative Erfassung Prozentsatz falscher Blüten Quantitative Ausprägung würde im Ernstfall aber kritisch zu bewerten sein.

10 P1 Espe Projektplan 7 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens vermittelt) und Kontrolle Jeweils zwei Varianten: ohne und mit rolC-Gen Das rolC-Gen verursacht eine gut erkennbare Wuchsveränderung. Jeweils 2 Varianten: ohne und mit Konstrukt für Frühblühen Je Variante 10 transgene Bäume geplant

11 rolC- Gen geringer Wuchs (B) hellgrüne Blattfarbe
Eigenschaften rolC-transgener Aspen (links, mitte) im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen (rechts).

12 P1 Espe Versuchsumfang (7 +1) * 2 * 2 = 32 Varianten = 320 Bäume
Kontrolle der transgenen Espen mit PCR Einbau nur eines Konstruktes wichtig, da mehrere Konstrukte sich gegenseitig beeinflussen könnten Ermittlung des Insertionsortes Anzucht der Bäume bis zur Blüte Beobachtung über mehrere Perioden

13 Konstrukte Promotor/Zielgen-Kombination Zielgewebe der Expression
Verfügbarkeit PTA29-Barnase Tapetum Dr. Debener PTA 29-Vst1 ClGPDHC- Barnase Pollen ClGPDHC-Vst1 PTA29-argE Prof. I. Broer Stigma-spez. Promotor-Barnase Stigma DefH9-iaaM Prof. A. Spena

14 P1 Espe Versuchsfragen: Vergleiche:
Zeigen die Konstrukte die gewünschte Wirkung? Ist die Wirkung ausreichend? Vergleiche: Jeweils mit gegen ohne Konstrukt, sowohl mit als auch ohne rolC-Gen (Einfach- gegen Doppeltransformation) Verschiedene Konstrukte miteinander

15 P1 Espe – Offene Fragen Es ist unbekannt, wann und wie intensiv die Espen blühen, es besteht aber die Hoffnung, dass dies in 1-3 Jahren realisierbar ist. Es ist unbekannt, ob die Konstrukte zu ausreichender männlicher oder weiblicher Sterilität führen. Es darf zur Erreichung des Zieles nur ein kleiner Teil falscher Blüten gebildet werden. Wer setzt fest , welcher Anteil tolerierbar ist (etwa 5%) ?

16 P1 Espe - Sicherheitsaspekte
Wenn die Espen blühen und der Mechanismus nicht mit Sicherheit erfolgt, könnte eine Ausbreitung stattfinden. Dem kann im Projekt dadurch vorgebeugt werden, dass die blühenden Bäume ins Gewächshaus gebracht werden. Nach Ablauf des Versuches wird die Fläche vollständig gerodet.

17 P1 Espe – biometrische Aspekte (1)
Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen Alle Konstrukte werden mit derselben Kontrolle verglichen. Zusätzlich interessiert der Vergleich der Kontrollen untereinander. Stichprobenumfang kein Problem, da viele Blüten vorhanden Zeitabhängigkeit Effekt unbekannt Blüte auch in Folgejahren, aber im Projektzeitraum wohl nicht mehr verfügbar

18 P1 Espe – biometrische Aspekte (2)
Quantitative Erfassung der Wirkung Idealfall: 100 %, jeder Abweicher widerlegt die Hypothese Realfall: vorgegebene Frequenz an Abweichern Ist die Frequenz genotypabhängig? Welche Verteilung liegt vor (binomial, Poisson, geklumpt) ? Wie ist die Frequenz zu bewerten?

19 P2 Apfel - Ziele Übertragung von Resistenzen über Transformation
Feuerbrand Apfelschorf Apfelmehltau Verhinderung der Auskreuzung transgener Bäume männliche Sterilität => kein Pollenflug aus der Anlage Parthenokarpie => samenlose Früchte Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative Erfassung Prozentsatz falscher Blüten

20 P2 Apfel Projektplan 6 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens vermittelt) und Kontrolle Transformation transgener und nicht transgener Linien der Sorte ‚Pinova‘ in vitro Kontrolle der Transformation PCR, Southern Blot, ELISA, ... Veredlung auf M9 mit ‚Hibernal‘ als Zwischenveredlung

21 P2 Apfel - Konstrukte Promotor/Zielgen-Kombination
Zielgewebe der Expression Zielstellung PTA29-Barnase Tapetum Pollensterilität PTA29-Vst1 CIGPDHC-Barnase Pollen CIGPDHC-Vst1 DefH9-iaaM Stigma Parthenokarpie Nin88-Nin88-antisense

22 P2 Apfel – biometrische Aspekte
Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen Alle Konstrukte werden mit derselben Kontrolle verglichen. Zusätzlich interessiert der Vergleich der Kontrollen untereinander. Vergleich transgen gegen nicht transgen Andere Aspekte ähnlich wie bei den Espen (P1)

23 Gliederung Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
Projektübergreifende Aspekte Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel Vertikaler Genfluss bei Rosen Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

24 P3 Rosen - Teilprojekt 1 Auskreuzungsrate bestimmter Rosentypen
Floribundarosen (‚Heckenzauber‘) Teehybriden (‚Pariser Charme‘) Erfassung der Polleneintragsrate über selbstinkompatible Fängerpflanzen (diploider Genotyp) in Abhängigkeit von Abstand: 0, 20 und 200 m Richtungen: 2-3 Standorte: Ahrensburg, Groß Lüsewitz Überprüfung der Auskreuzungsrate an Samen mittels molekularer Marker

25 P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Versuchsplan)
Versuchskern: 5 Pariser Charm 5 Heckenzauber F PC F F F F Heck F 20 200 Mantel: 20 Fängerpflanzen in 20 bzw. 200 m Entfernung: je 5 Fängerpflanzen 20 F Merkmale: Zahl der Früchte zu Zahl der Blüten Je Fängerblock max. 20 Samen 200 F

26 P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Auswertung)
Früchte pro Blüte Heckenzauber und Pariser Charme als Kontrollen für die selbstinkompatiblen Fängerpflanzen Vergleich von Anteilen; 2 Orte Samenkeimrate bei Fängerpflanzen mehrdimensionale Kontingenztafel Orte, Abstände, Richtungen Herkunft von Samen bei Fängerpflanzen Orte, Abstände, Richtungen sowie Genotypen (Heckenzauber‚ Pariser Charme, andere Quellen)

27 P3 Rosen - Teilprojekt 2 Auskreuzungsrate aus Kulturrosen in Wildrosen
Quelle: 2 Rosenzuchtbetriebe Empfänger: natürlich vorkommende Wildrosen in der Umgebung Versuchsplan Anzahl Wildrosen unbekannt, daher kein Plan möglich max. 100 Samen pro gefundener Pflanze max Samen Auswertung Anteil Samen auf Wildrosen aus Auskreuzung Identifizierung über molekulare Marker

28 Gliederung Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
Projektübergreifende Aspekte Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel Vertikaler Genfluss bei Rosen Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

29 P4 und P5 Pappeln: Ziele Projektplan
Freisetzung transgener Pappeln mit dem Ziel der Schwermetallaufnahme zur Entgiftung verseuchter Böden. Hintergrund ist die Überexpression cytosolischer -Glutamylcystein-Synthetase (cyt-ECS) transgener Pappeln. Stabilität des Transgens über mehrere Perioden Erfassung des horizontalen Gentransfers über Mykorrhizen

30 P4 Pappeln Versuchsumfang Beobachtungszeitraum Vergleiche
2 Standorte (Mansfelder Land, Ekatarinenburg) 3 Belastungsgrade mit Kupfer transgene Pappeln und Kontrollen randomisiert in 50*50 m² Parzellen Beobachtungszeitraum 3 Jahre (geplant), jedes Jahr werden einige Bäume zur Untersuchung gerodet und ergeben Lücken. Vergleiche zwischen Kontrollbäumen und transgenen Bäumen zwischen Kupferbelastungen für jeden Standort getrennt

31 P4 Pappeln - Versuchsplan
Mansfelder Land Ekatarinenburg geringe Kupferbelastung mittlere Kupferbelastung ( ) keine Fläche gefunden hohe Kupferbelastung P4 Pappeln - Versuchsplan

32 P4 Pappeln – Versuchsplan (Detail)
17 25 19 15 11 10 13 8 18 21 35 24 26 1 36 14 3 31 12 6 7 30 2 29 33 28 34 32 9 27 20 16 23 22 5 4 Ausschnitt; schwarz = Kontrolle, rot = transgen Insgesamt 144 = Bäume + 2 Reihen Kontrolle als Mantel

33 P4 Pappeln – Analyse des Entgiftungsprozesses (1)
Zu Beginn des Versuches Bodenproben an verschiedenen Stellen Während der Vegetation 3 Probenahmetermine im Abstand von 2 Monaten Messung der Konzentration an Thiolen (Glutathion und Phytochelatine) in den Blättern (HPLC) Messung der Expression des gshl Gens (Northern Blot)

34 P4 Pappeln – Analyse des Entgiftungsprozesses (2)
Am Ende der Vegetation jedes Jahr Rodung von 10 Kontroll- und 10 transgenen Bäumen je Parzelle Chemische Analyse der Biomasse (in Blätter und Holzteile getrennt) auf 10 Schwermetalle Bodenproben an den Entnahmestellen Sammeln der Blätter nach Laubfall (vermeidet Wiedereintrag) Am Ende des Versuches Rodung der Flächen Verbrennung und Ascheanalyse auf Schwermetalle Bodenproben an verschiedenen Stellen

35 P5 Pappeln und Mykorrhizen
Schwerpunkte sind: Untersuchung des Einflusses der verstärkten Schwefelaufnahme durch transgene Pappeln auf die Zusammensetzung der für Pappeln wichtigen Mykorrhizen Beeinflussung der Schwefelaufnahme transgener Pappeln durch Mykorrhiza Untersuchungen zum horizontalen Gentransfer (Übertragung von Transgenen von der Pappel auf Mykorrhizen). Hierzu dient der Versuch zur Bodenentgiftung (P4).

36 P4 und P5 Pappeln –Mykorrhiza
Mykorrhizisierungsgrad an Stichproben ( Bäume) Anzucht der gefundenen Mykorrhizen und deren Bestimmung der Arten Verschiedene Entnahmezeitpunkte, um Umwelteinflüsse zu erfassen Da horizontaler Gentransfer ausgesprochen selten erwartet wird, ist eine biometrische Analyse kaum möglich.

37 Gliederung Struktur des Forschungsverbundes Gehölze
Projektübergreifende Aspekte Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel Vertikaler Genfluss bei Rosen Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

38 P6 Wein – Auswirkung transgener Reben auf Arthropoden als Nichtzielorganismen
A: Laborversuche zum Einfluss von Enzymen und Insektenpathogenen auf Larven von Lobesia botrana (Traubenwickler, Schädling) und Typhlodromus pyri (Raubmilbe, Nützling) B: Gewächshausversuche mit transgenen Reben, die diese Enzyme enthalten C: Freisetzungsversuche mit transgenen Reben

39 P6 Wein – Auswirkung transgener Reben auf Arthropoden als Nichtzielorganismen
Enzyme CHI (Chitinase) GLU (1,3 Glucanase) RIP (Ribosom-inhibierendes Protein) Insektenpathogene Bacillus thuringiensis Entomopathogene Pilze Erfasste Wirkungen Direkte Toxizität der Enzyme Synergistische und antagonistische Wirkungen der Enzyme über die Insektenpathogene

40 P6 Wein – Biometrische Aspekte
Toxizität über Probitanalyse LD50 sowie LD20 und LD80 Schwellenwerte über Vorversuche Mikroskopische Untersuchungen Beschaffenheit der Matrix des Mitteldarmes wird an 10 Larven je Stufe analysiert Sequentielle Vorgehensweise Das Ergebnis der Laborversuche bestimmt das Vorgehen im Gewächshaus, dieses wiederum die Strategie bei den Freilandversuchen

41 Zusammenfassung Der Verbund ist vergleichsweise heterogen.
Die Dauerhaftigkeit der Gehölze verträgt sich schlecht mit der zeitlich befristeten Projektdauer. Die Möglichkeiten der biometrischen Versuchsplanung sind bei Freilandversuchen und z. T. auch im Gewächshaus stark eingeschränkt. Einige Ereignisse werden nur selten erwartet, der für sichere Aussagen notwendige große Stichprobenumfang ist aber technisch meistes nicht machbar. Im Vordergrund steht der Erkenntnisgewinn, nicht die Sicherheit.