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Experiment 1: DNA-Extraktion Aufschluss der Zellulären DNA: zunächst notwendiger Zugang zur DNA --> mit Wattestäbchen abgenommene Schleimhautzellen werden.

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2 Experiment 1: DNA-Extraktion Aufschluss der Zellulären DNA: zunächst notwendiger Zugang zur DNA --> mit Wattestäbchen abgenommene Schleimhautzellen werden in Wasser abgelöst Zugabe der Enzyms Proteinase K und aufkochen --> Auflösung der Membran von Zelle und Mitochondrien, Freilegung der DNA

3 Hinzufügen eines Harzgranulats, um DNA in wässriger Lösung zu stabilisieren

4 Experiment 2: PCR Ziel: Vervielfältigung der hyper-variablen mtDNA- Region 1 und 2 (HVR 1+2) Durchführung: Vermehrung bestimmter DNA- Stücke(HVR 1+2) durch Anlagerung von Primern als Startmoleküle des Enzyms DNA-Polymerase

5 3 Teilschritte: 1. Denaturierung der DNA bei 94°C --> Aufschmelzen der DNA in ihre Einzelstränge 2. Binden der Primer an beide DNA-Einzelstränge bei 55°C 3. DNA-Synthese bei 72°C --> DNA-Einzelstränge werden kopiert

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7 Die kopierten DNA-Stücke werden im nächsten Durchgang mitrepliziert insg Zyklen --> bis zu 4 Milliarden Kopien des zu untersuchenden DNA-Abschnittes für beide zu untersuchenden DNA-Fragmente (HVR1+2) gibt es Primer und Gegenprimer, so das bp-Fragmente von329 bis 385 bp vervielfacht werden

8 Experiment 3: Restriktions- Spaltung der PCR-Produkte Restritionsenzyme: Klasse von bakteriellen Enzymen in der Lage, doppelsträngige DNA an spezifischen Sequenzen zu spalten biologische Funktion: Spaltung fremder DNA, die in Bakterienzelle eingedrungen ist

9 mittlerweile mehr als 100 verschiedene Restriktionsenzyme bekannt Restriktionsenzyme erkennen auf doppelsträngiger DNA spezifische Erkennungs-Sequenzen --> sind von hinten und von vorne gleich aufgebaut; entsprechende RE bestehen aus zwei Untereinheiten, die jweils ihre Sequenz am DNA-Einzelstrang erkennen einige Restriktionsenzyme erzeugen glatte Enden, andere einander komplementäre, wiederverschließbare 5´ bzw. 3´überhängende Enden

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12 Experiment 4: Agarose – Gelelektrophorese DNA lässt sich in Agarose-Gel durch Anlegen einer Spannung bezüglich ihres Molekulargewichtes auftrennen, da Agarose netzähnliche Hohlräume aufweist. Die DNA-Moleküle wandern von der Kathode(-) zur Anode(+). Die Geschwindigkeit mit der sie wandern hängt von ihrer Größe ab. Kleinere Moleküle wandern schneller als größere Moleküle.

13 Die Agarosekonzentration im Gel kann zwischen 0,7% - 4% liegen, je kleiner die DNA-Moleküle, desto höher muss die Agarosekonzentration sein.(kleinere Hohlräume) Banden werden mit Ethidiumbromid angefärbt. Ethidiumbromid lagert sich an die DNA- Doppelhelix an und leuchtet orange unter UV-Licht.

14 Herstellung von Agarosegel und in Gussform gießen, Kämme stecken, abkühlen lassen PCR-Produkt mit einer Gelladelösung vermischen Restriltionsproben mit Gelladelösung vermischen Zum Vergleich abwechselnd verdautes und unverdautes PCR-Produkt in die Geltaschen pipetieren bei 100 Volt ca. 1h Elektrophorese durchführen, danach auf UV-Tisch fotografieren

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16 Gelladelösung: Enthält 2 Farbstoffe: Bromphenolblau(500bp) und Xylencyanol(3000bp) Schwerelösung (Glycerin oder Sucrose), welches die Viskosität erhöht und das Pipetieren der Probe in die Gel-Tasche erleichtern soll.

17 Experiment 5: Sequenzanalyse der PCR-Produkte Mit PCR ausreichend Kopien der mtDNA-Region HVR1 hergestellt PCR-Produkte müssen aufgereinigt werden PCR-Produkte passieren durch Zentrifugalkraft eine poröse Matrix, welche nur die PCR-Produkte passieren lässt

18 Sequenzreaktion wird durchgeführt Sequenzreaktion= PCR mit nur einem Primer, es werden Nukleotide, als auch modifizierte Nukleotide hinzugegeben Wenn ein modifiziertes Nukleotid eingebaut wird, bricht der Kopiervorgang ab modi. Nukleotide sind farbmarkiert Einbau der modi. Nukleotide läuft zufällig ab, daher decken modi. Nukleotide den gesamten Sequenzbereich ab

19 DNA-Fragmente müssen jetzt geordnet werden Sortieren nach Größe und detektieren der Farbe übernimmt eine Sequenziermaschine Gleicher Vorgang in der Maschine wie bei einer Gelelektrophorese, nur am Ende ein Laser der die Farbe abliest.

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