Die Zelle. Untersuchungsmethoden der Struktur von Zellen und Geweben

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1 Die Zelle. Untersuchungsmethoden der Struktur von Zellen und Geweben
Prof. Dr. Pál Röhlich ÁOK 2012/13, Erstes Semester: Grundlagen der Zellbiologie 10. Sept. 2012

2 Die Zelle, Zellbiologie
Lebewesen sind aus Zellen aufgebaut. Die Zelle ist die kleinste strukturelle und funktionelle Einheit, die noch die grundlegenden Lebenserscheinungen zeigt, d.h. ist für selbständiges Leben fähig. (nimmt Nährstoffe von der Umgebung auf und transformiert sie um Energie zu gewinnen und um eigene molekulare Komponenten aufzubauen, synthetisiert Makromoleküle nach eigenem genetischen Programm, ist fähig sich durch Zellteilung zu reproduzieren, während dessen ihr genetisches Programm ohne Fehler weitergegeben wird, kann sich an die Umgebung adaptieren, nimmt Signale von der Umgebung auf und reagiert auf sie, bewegt sich aktiv mit Hilfe von Energie, baut durch Phagocytose aufgenommenen Teilchen mit Hilfe von lysosomalen Enzymen ab, …) Die Zelle ist das beste Modell um die grundlegenden Lebensprozesse zu vestehen und deshalb steht im Mittelpunkt der Biowissenschaften. Zwei Haupttypen von Zellen: prokaryotische, primitive Zelle, wichtigster Vertreter: Bakterium (Kapsel, Zellmembran, keine Zellorganellen, Vorstufe des Zellkerns: „Pro-karyon”, ringförmiges DNA Molekül). Größe unter 1 μm. eukaryotische Zelle mit komplexer Struktur, echter Zellkern („Eu-karyon”: Chromatin, Chromosomen), Zellorganellen, membranbegrenzte Kompartimente, Grösse zwischen 6 und 50 μm. Einzellige und mehrzellige Lebewesen. Maßeinheiten: 1 Mikrometer (μm) = 10-3 mm, 1 Nanometer (nm) = 10-3μm Zellehre (Zytologie): klassischer Wissenschaftzweig der Biologie, beschäftigt sich vor allem mit dem Aufbau der Zelle Zellbiologie: integrative Wissenschaft, summiert und integriert alle Kentnisse über strukturelle, molekulare, physiologische, physikalische usw. Eigenschaften der Zelle. Einheit von Struktur und Funktion. Unterricht der Zellbiologie an der Semmelweis Universität.

3 Vergleich der pro- und eukaryotischen Zellen (Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Makrophagzelle mit phagocytierten Bakterien) prokaryotische Zelle (Bakterium) Eukaryotische Zelle (Makrophag)

4 Bestandteile einer idealisierten tierischen Zelle (licht- und elektronenmikroskopisches „Inventar”)
Mikrovilli Kinocilium intermediäre Filamente Stereocilium Phagozytose corticale Aktin-Filamente Phagosom Kernhülle Lysosom Peroxisom Mitochondrium sekretorisches Granul Zellkern Chromatin Exozytose Mikrotubulus Nucleolus Golgi-Apparat Fetttröpchen Pinozytose coated pit Glykogen Granulen  Centrosom glattes endoplasmatisches Reticulum (sER) rauhes endoplasmatisches Reticulum (rER)

5 Gliederung der tierischen Zelle
Membran-begrenzt (ER, Golgi, Lysosom, Mitochondrium, transport Vesikeln, Peroxisom, …) Zellmembran Zelle Zellkern Zellorganellen Protoplasma keine Membran (Cytoskelett, Ribosom) reserve Nährstoffe (Einschlüsse) Cytoplasma Cytosol

6 Mikroskope 1. Optische Abbildung 2. Raster- (scanning) Methode
Zwei Grundmethoden der Abbildung 1. Optische Abbildung (Linsensysteme bilden ein vergrößertes Bild). 2. Raster- (scanning) Methode (Das Objekt wird linienweise mit einem Lichtpunkt abgetastet und aus den registrierten und verstärkten Signalen setzt sich ein vergrößertes Bild an einem Bildschirm zusammen. Die Vergrößerung ergibt sich aus dem Verhältnis zwischen den Größen der abgetasteten bzw. abgebildeten Felder)

7 A. van Leeuwenhoek (1632-1723) und sein „Mikroskop”

8 Architekt, Naturwissenschafter,
Robert Hooke Architekt, Naturwissenschafter, Seine mikroskopische Beobachtungen publizierte er in einer Monographie: Micrographia. Der Name Zelle stammt von ihm: an dünnen Schnitten von Pflanzenblättern hat er kleine Kammern (cella, cellula) beobachtet, diese entsprechen den Zellwänden der Pflanzenzellen. Mikroskop von Hooke

9 Strahlengang in einem Forschungsmikroskop
Camera Projektivlinse Okularlinse Objektivlinse Mikroskop- Stativ Mikroskoptisch Kondensorlinse Kondensor- Blende Lichtquelle (Lampe) Lichtfeldblende 

10 (Auflösungsvermögen)
Bildqualität (Auflösungsvermögen) Mindestabstand (d) zwischen zwei Punkten im Objekt, die noch als einzelne Punkte identifiziert werden können. Abbé Formel: d = 0.61 λ / n sin α λ = Wellenlänge des verwendeten Lichtes n = Brechungsindex des Mediums zwischen Objekt und Objektivlinse α = Halber Öffnungswinkel der Objektivlinse n sin α = numerische Apertur (NA) Auflösungsvermögen des Lichtmikroskops: etwa 0,3 μm Gesamtvergrößerung Vergrößerung der Objektivlinse x Vergrößerung der Okularlinse Optische Achse

11 I. Die klassische Methode (histologische Dauerpräparate)
Vorbereitung der Zellen und Geweben für die mikroskopische Untersuchung I. Die klassische Methode (histologische Dauerpräparate) * Fixierung (chemische Fixierung). Stabilisieren der Strukturen durch Quervernetzung der Makromoleküle oder Denaturierung der Proteine. Häufigste Fixationsmitteln: 4-10% Formaldehid, 2-4% Glutardialdehid (die Aldehydgruppen bilden starke kovalente Bindungen mit reaktiven Gruppen der Proteine). * Färbung. Die Zellen im Mikroskop sind fast durchsichtig, feine Einzelheiten sind nicht sichtbar. Lösung des Problems: Färbung der Zellen und Geweben mit verschiedenen Farbstoffen. Die meisten Farbstoffe binden sich an Zellen und interzelluläre Strukturen auf Grund ihrer elelektrischen Ladung (elektrostatische Wechselwirkung) oder durch hydrophobe Wechselwirkung. Farbstoffe mit positiver Ladung (basische Farbstoffe) (zB. Haematoxilin, Methylenblau, Toluidinblau, Ruteniumrot, usw.) binden sich an Moleküle mit negativer Ladung (zB. Nukleinsäuren, Glykosaminoglykane): „basophile Strukturen”. Farbstoffe mit negativer Ladung (saure Farbstoffe) (zB. Eosin, Fuchsin) färben positiv-geladene Strukturen (zB. Mitochondrien, Kollagenfasern, Muskelzellen): „acidophile Strukturen”. Farbstoffe ohne elektrischer Ladung (hydrophobe, neutrale Farbstoffe) (zB. Sudanschwarz, Scharlachrot) lösen sich in fettartigen Substanzen (Fetten und Lipiden): „Fettfärbung” Mehrfachfärbungen (zB. Haematoxilin-Eosin, Azan, Mallory, Trichrom) Metallimpregnationen (Metall-Ionen binden sich an verschiedene Strukturen, die mit reduzierenden Mitteln in dunkles Metall umgewandelt werden können (zB. braune oder schwarze Farbe bei Silberimpregnation). Impregnierte Strukturen: Golgi-Apparat, neurale Strukturen, Gitterfasern, bestimmte Sekretgranulen, usw. * Anfertigung von Schnitten bei Geweben oder Organen

12 Mikrotomie (Schneiden)
I. Schnitte aus eingebettetem Material („Paraffinschnitte”). 1. Paraffin-Einbettung Entwässerung in aufsteigender Alkoholreihe Intermedium (Fettlösungsmittel, zB. Xylol) Durchtränkung mit geschmolzenem Paraffin (56oC) Ausgießen in Blokkform, Abkühlung 2. Schneiden: mit einem Mikrotom (5 μm dicke Schnitte), Ausbreiten der Schnitte an warmem Wasser, Antrocknen an Objektträger.  Schlittenmikrotom II. Gefrierschnitte aus gefrorenem Gewebestück

13 Gefärbte weiße Blutzellen vom roten Knochenmark mit starker Vergrößerung


14 Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszenz: bei Beleuchtung eines fluoreszierenden Stoffes mit einem Licht von einer bestimmten Wellenlänge emittiert das fluoreszierende Molekül ein Licht mit größerer Wellenlänge (erregendes und emittiertes Licht). Fluorochrome: fluoreszente Farbstoffe Fluoreszenzmikroskop: spezielles Mikroskop adaptiert für die Beobachtung fluoreszierender Stoffe in den Zellen und Geweben. Erregende Lichtsrahlen emittierende Lichtquelle, Lichtfilter, Beleuchtung von oben (durch die Objektivlinse, „Epifluoreszenz”), schräger dichroischer Filter (oder Spiegel) Vorteil: sensitive Methode, wenige fluoreszierende Moleküle können auch nachgewiesen werden („Sterne am Himmel”) Fluoreszente Proteine: Fluoreszierende Proteine aus Meerestieren (Wirbellosen). Vorteil: Untersuchungen in lebenden Zellen (Untersuchung der Genexpression eines bestimmten Proteins durch Fusion der Gene, Markierung und Folge bestimmter Proteine usw). Verwendung: Cytochemie (Immunfluoreszenz, in situ Hybridisierung: FISH, Lektin-Cytochemie), fluoreszente Indikatoren für die Untersuchung intrazellulärer Ionenkonzentrazionen und Lokalisationen. Blende Emissionsfilter dichroischer Filter Erregerfilter Kondensor Lichtquelle (zB. Quecksilberlampe) Objektivlinse   Präparat Bündeln von Aktin-Mikrofilamenten rot, Zellkerne blau

15 Konfokales Mikroskop (laser scanning confocal microscope)  
Lochblenden Strahlengang des erregenden Lichtes Strahlengang des emittierten Lichtes  im Fokus ausser Fokus Ein Fluoreszenzmikroskop mit Laserstrahl als Lichtquelle. Der erregende Lichtstrahl passiert durch eine kleine Lochblende und ist mit einem Spiegel (im Tubus) und mit dem Objektiv in die Ebene des Präparates als kleiner Lichtpunkt projiziert. Wenn dort eine mit Fluorochrom-markierte Struktur ist, wird der austretende Lichtstrahl durch die Objektivlinse in der Ebene einer anderen Lochblende fokussiert und erregt einen Detektor. Lichtstrahlen von Strukturen über oder unter der Fokusebene im Präparat können praktisch durch die Lochblende nicht passieren und sind ausgeschaltet. Der punktförmige Laserstrahl tastet das Präparat ab und mit dem Raster-Prinzip wird am Bildschirm ein scharfes Billd erzeugt. Vorteil. sehr scharfes Bild in der Fokusebene des Objektivs (keine störende Überlappungen), von Bildinformationen in vielen Fokusebenen kann eine dreidimensionelle Struktur mit dem Rechner rekonstruiert werden  Bild im Fluoreszenzmikroskop Bild im konfokalen Mikroskop

16 Cytochemie (Histochemie)
Nachweis von chemischen Komponenten (zB. Makromolekülen) in Zellen und Geweben. Zell- (oder Gewebs-) Präparate können mit verschiedenen Methoden untersucht werden, einige Beispiele: Chemische Reaktionen durchgeführt an cytologischen oder histologischen Präparaten, Endprodukt farbig (zB. Feulgen-Reaktion für DNS) Chemische Reaktionen katalisiert durch Enzyme in den Geweben zB. Nachweis von Enzymen (Enzymcytochemie), Endprodukt farbig Einbau von radioaktiven Isotopen in bestimmte Makromoleküle (zB. Isotop-markierte Thymidin bei DNS), Nachweis mit Photoemulsion (Autoradiographie), Endprodukt: schwarze Silberkörnchen Spezifische makromolekuläre Bindungen („Affinitätscytochemie”) Immuncytochemie Lektincytochemie in situ Hybridisierung

17 Immuncytochemie Grundprinzip: die B-Zellen des Immunsystems können gegen körperfremde Stoffe (zB. Makromoleküle) sogenannte Antikörper (Proteine: Immunglobuline) produzieren, die spezifisch diese Moleküle (oder Teilstrukturen dieser Moleküle: Epitope) binden. Diese Bindung kann für den Nachweis dieser Moleküle in zellulären (oder Gewebs-) Präparaten verwendet werden. Immunglobulin G: Y-förmiges Proteinkomplex (mit 2 schweren und 2 leichten Ketten). An den Enden der zwei Ärmen des Immunglobulins sind die spezifischen Bindungsstellen. Nachweis des gebundenen Antikörpers in den zellulären (oder Gewebs-) Strukturen (mit direkten oder indirekten Methoden): mit Ankopplung eines Fluorochroms (beobachtet in einem Fluoreszenzmikroskop), oder mit Ankopplung eines Enzyms, dessen Reaktionsprodukt farbig ist. Polyklonale und monoklonale Antikörper Mitotische Zelle: Mikrotubuli grün, Kinetochoren violett, Chromosomen blau 

18 Zwei einfache Methoden der Immunfluoreszenz
Direkte immunzytochemische Reaktion: Antikörper gegen das nachzuweisende Molekül ist mit einem Fluoreszenz-Farbstoff (Fluorochrom) markiert , Indirekte immunzytochemische Reaktion: gegen den ersten, spezifischen Antikörper ist ein zweiter Antikörper (in einer anderen Tierart) produziert, der mit Fluorochrom markiert ist. Nachzuweisendes Molekül Nachzuweisendes Molekül Primärer Antikörper mit Fluorochrom markiert Primärer (spezifischer) Antikörper Direkte immunzytochemische Reaktion Sekundärer Antikörper mit Fluorochrom markiert Indirekte immunzytochemische Reaktion 

19 Mosaik der Zapfenzellen in der Retina eines Versuchstieres
Doppel-Immunfluoreszenz Mosaik der Zapfenzellen in der Retina eines Versuchstieres Rotempfindliche Zapfenzellen sind mit einem mit rotfluoreszierenden Fluorochrom markierten spezifischen Antikörper nachgewiesen, blauempfindliche Zapfen sind als gelbgrüne Punkte sichtbar (blauspezisches Antikörper mit grünfluoreszierendem Fluorochrom markiert). 

20 Lektin-Cytochemie  PNA  WGA
Einige pflanzliche Proteine (Lektine) binden sich spezifisch an bestimmte Kohlenhydrate. Diese Lektine können zum Nachweis der Kohlenhydrate in den Zellen oder Geweben verwendet werden. PNA Erdnuß-Lektin (peanut agglutinin, PNA) bindet das Disaccharid β-Galaktose 1-3 N-Acetylgalaktosamin, das z.B. in der Hülle der retinalen Zapfenzellen zu finden ist. Das dunkle Reaktionsprodukt zeigt die Lokalisation dieses Disaccharids. Weizenkeim-Lektin (wheatgerm agglutinin, WGA) bindet an Sialsäure und N-Acetylglukosamin. Solche Kohlenhydrate kommen in den schleimproduzierenden Zellen des Darmepithels, in den Becherzellen vor. Das Lektin wurde mit einem Fluorochrom markiert und die Schleimsubstanz in den Becherzellen ist hier in Form von leuchtenden, ovalen Flecken zu sehen. (Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme).  WGA

21 In situ Nukleinsäurehybridisierung
Eine mit der nachzuweisendender Nukleinsäure komplementäre Oligonukleotid-Probe wird synthetisiert, und mit einem Fluorochrom oder mit einem Antigen markiert. Mit der markierten Probe wird das Zell- oder Gewebepräparat behandelt, die Probe bindet sich spezifisch an die gesuchte Nukleinsäure (Hybridisierung), die dadurch im Mikroskop sichtbar wird. Typische Verwendungen: Lokalisation eines bestimmten Gens oder Centromer-Region an Chromosomen, Untersuchung der Transkription durch Nachweis der entsprechenden mRNS, Untersuchung von Vireninfektion durch Nachweis von viraler Nukleinsäure, … Fluorochrom Oligonukleotid-Probe ISH mit fluorochrommarkierter Probe Antigen (Digoxigenin) Oligonukleotid-Probe Enzym (Phosphatase) Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) zur Lokalisierung von Centromer-Regionen und einem Gen im Zellkern einer menschlichen Zelle (Urothel). Rot: 3. Chromosom, grün: 7.Chromosom, blau: 17. Chromosom (Centromer), Gelb: Gen des Tumorsuppressors p16. Präparat und Aufnahme von Dr. Gábor Lotz Antikörper farbiges Präcipitat Substrat  ISH mit antigengekoppelter Probe und enzymcytochemischer Reaktion

22 Transmissions-elektronenmikroskop
Lampe Glühfaden (Kathode) elektromagnetische Linsen Kondensor Präparat Zwischenbild Lichtmikroskop Elektronenmikroskop Vakuum, elektromagnetische Linsen, Hochspannung ( KV), Bild: am Fluoreszenzschirm oder Photoaufnahme Auflösungsvermögen: 0,2 nanometer! Vergrößerung: von 500x bis x Präparat: sehr dünn (weniger als 100 nm) Lebende Zellen können nicht untersucht werden! Kontrast: „Färbung” mit Elementen von hohen Atomnummern (Os, Ag, Au, Pb, usw.) 

23 Untersuchungsmaterial, eingebettet in Kunstharz
Ultramikrotom Dicke der ultradünnen Schnitte: nm 1/10 der Wellenlänge des sichtbaren Lichtes! Von einer Zelle können etwa 200 Ultradünnschnitte angefertigt werden. Untersuchungsmaterial, eingebettet in Kunstharz Glasmesser  Die Ultradünnschnitte sind auf feine Kupfernetze aufgenommen Rand des Schnittes 

24 Elektronen-mikroskopische Aufnahme von einem Ultradünnschnitt.
Ausschnitt aus einer Leberzelle. 

25 Semidünnschnitte 0,5 μm dicke Schnitte (mit Ultramikrotom geschnitten) Färbung: mit Toluidinblau und Azurblau. Vorteil: sehr feine Einzelheiten der Zellen sichtbar. Leberzellen mit starker Vergrößerung. Mitochondrien als kleine Punkte sichtbar. 

26 EM Immuncytochemie an ultradünnen Gefrierschnitten
Lokalisation von Cathepsin D in den Lysosomen in Form von kleinen (schwarzen) Goldpartikeln. Am Ultradünnschnitt einer Leberzelle gebundene spezifische Antikörper sind mit an Goldpartikeln adsorbierten sekundären Antikörpern nachgewiesen. Lysosom Goldpartikel 1. Antikörper 2. Antikörper an ein Goldpartikel adsorbiert  W. Liou felvétele

27 Raster- (scanning) Elektronenmikroskop
  Ein einfaches EM, wo der Elektronenstrahl in einem Punkt an der Präparatoberfläche fokusiert ist. Der Elektronenstrahl schlägt von den oberflächlich liegenden Atomen sekundäre Elektronen aus, die durch einen Detektor registriert werden. Der dünne Elektronenstrahl tastet die Oberflache linie zu Linie ab, Punkt zu Punkt ab, die im Detektor enstandenen elektrische Signale werden verstärkt und für die Steuerung des Elektronenstrahls eines Bildschirmes benutzt. Das entstandene, stark vergrößerte Bild gibt eindrucksvolle 3D Information über die Oberfläche des Präparates.

28 Rote und weiße Blutzellen in einem kleinen Blutgefäß.
Raster- (scanning) elektronenmikroskopische Aufnahme.

29 II. Mikroskopische Beobachtung lebender Zellen
Ziel: Untersuchung von Zellbewegungen, Zellteilung, intrazellulärem Transport, Reaktion der Zellen auf experimentelle Einwirkungen, … Schwierigkeit: lebende, ungefärbte Zellen sind kontrastarm und kaum im Mikroskop sichtbar Lösung: Steigerung des optischen Kontrastes mit speziellen mikroskopischen Einrichtungen: das Wesentliche: der Lichtstrahl dringt durch verschiedene optische Medien mit verschiedenen Phasenverschiebungen durch, die aus dem Objekt austretenden Strahlen werden interferiert und dadurch Phasenunterschiede in Amplitudenunterschiede umgewandelt. Mikroskopisches Bild einer lebenden Zelle mit kontraststeigernden Verfahren Differenzialinterferenz- kontrast (DIC) Verfahren  ohne Kontraststeigerung Phasenkontrast-Verfahren

30 Zellkultur Unter geeigneten Lebensbedingungen (Nährstoffe, Sauerstoff, Wachstumsfaktoren, Sterilität, Temperatur, usw.) können die Zellen ausserhalb des Organismus („im Glas”, in vitro) überleben, sogar sich vermehren: Zellzüchtung oder Zellkultur. Zellkultur ist die häufigste Quelle für Untersuchung lebender Zellen. Haften der Zellen an den Untergrund, konfluente Zellkultur, Monolayer. Zellinien (unsterblich, mit bestimmtem Differenzierungsgrad, Modellzellen für die Zellbiologie) Aufnahme von Zellbewegungen mit video (früher mit Film) Mikrokinematographie. Künstliche Beschleunigung der Bewegungen. Lagerung der Zellen für Jahre mit Tiefkühlung (in Flüßigstickstoff). Wissenschaftliche Anwendungen: Zelldifferenzierung, bösartige Zelltransformation, Wirkungen von verschiedenen Stoffen an die Zellen, Zell-Zellwechselwirkungen, Zellteilung, Zellwanderung. Praktische Anwendungen: Vermehrung der Zellen für therapeutische Zwecke, Vermehrung von Stammzellen, Produktion von monoklonalen Antikörpern, in vitro Toxicitätsuntersuchung, Isolierung der Chromosomen für diagnostische Zwecke, usw.

31 Muskelbildende Zellen (Myoblasten) Bindegwebszellen (Fibroblasten)
Gezüchtete Zellen (Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen)   Muskelbildende Zellen (Myoblasten) Bindegwebszellen (Fibroblasten)

32 Lehrstoff Stoff vorgetragen an den Vorlesungen (bitte machen Sie Notizen!) Stoff der Vorlesungen an der Webseite des Institutes (Powerpoint Presentationen): Lehrhilfe, Vorlesungen, Kennwort: stapes Lüllmann-Rauch: Histologie, Thieme Verlag, Stuttgart (ausgewählte Kapitel) Empfohlen: Alberts-Bray-Johnson-Lewis-Raff-Roberts-Walter : Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, („der kleine Alberts”) 3. oder 4. Auflage, Wiley-VCH, (ausgewählte Kapitel). Wenn jemand noch mehr wissen möchte (in englischer Sprache): Alberts-Bray-Johnson-Lewis-Raff-Roberts-Walter: Molecular Biology of the Cell, 5th Edition, Garland Science, New York („der große Alberts”)

33 Kapitel in den Lehrbüchern: Quellen der Illustrationen:
Lüllman-Rauch: Histologie, 2. Auflage, Kapitel 27 Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, 3. Auflage, Kapitel 1.2, 1.3, 1.4 Quellen der Illustrationen:  Röhlich: Szövettan, 3. Auflage, Semmelweis Verlag, Budapest  Alberts – Johnson – Lewis – Raff – Roberts – Walter: Molecular biology of the cell. 5. Auflage, Garland Science  Junqueira - Carneiro: Histologie, 6. Auflage, Springer  Röhlich: eigene Präparate, Aufnahmen oder Zeichnungen