Arbeitsanweisungen zur Durchführung des DNA-Fingerprinting-Experiments

Präsentation zum Thema: "Arbeitsanweisungen zur Durchführung des DNA-Fingerprinting-Experiments"—  Präsentation transkript:

1 Arbeitsanweisungen zur Durchführung des DNA-Fingerprinting-Experiments

2 1. Ansetzen der Restriktion

3 1.1 Beschriften der Tubes DNA [µl] 10 10 10 10 10 10 Beschriftung
TO V V 2 V V V5 DNA [µl] 10 10 10 10 10 10 Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V1 - V5)

4 1.2 Zugabe von 10 µl Enzymmix Enzymmix (E) [µl] 10 10 10 10 10 10
TO V V V V V5 Enzymmix (E) [µl] 10 10 10 10 10 10 Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V1 – V5) 4 4

5 2. Restriktionsverdau 20 Minuten bei 37 oC im Thermoblock Modell:

6 3. Während des Restriktionsverdaus Elektrophorese vorbereiten

7 3.1 Vorbereiten der Kammer
Einsetzen des Schlittens, der Metallkeile und des Kamms in die Elektrophoresekammer

8 3.2 Herstellen des Agarosegels (0,8%)
0,24 g Agarose (AG) + 30 ml TAE-Puffer (1x) Gemisch in der Mikrowelle kurz aufkochen, umschwenken und erneut kurz zum Kochen bringen Gel muss schlierenfrei sein!

9 3.3 Befüllen der Gelkammer
Gel auf ca. 55 oC abkühlen lassen (Handrückentest) und gießen Achtung: Kammer bis zum Erstarren des Gels nicht mehr bewegen Abb.: Gießen des Agarose- gels in die Kammer

10 3.3 Befüllen der Gelkammer
Nach Erstarren des Gels, Metallkeile entfernen Gel mit ca. 270 ml TAE- Puffer (1x) überschichten Kamm ziehen Achtung: die Taschen müssen frei von Luftblasen sein

11 4. Vorbereiten des Längenstandards
Zu 10 µl Längen-standard (M) werden 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert Inhalt (20 µl) gut ver-mischen M

12 5. Zugabe des Ladepuffers
In die Tubes TO und V1 – V5 werden jeweils 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert Inhalt (30 µl) gut ver-mischen 10 µl 10 µl 10 µl

13 6. Füllen der Geltaschen Linke Randspur bleibt frei
Je 20 µl der Proben TO und V1 – V5 bzw. 20 µl Längen-standard (M) in jeweils eine Geltasche pipettieren Reihenfolge beachten!!! Spuren: von links nach rechts

14 6. Füllen der Geltaschen Achtung: Geltasche darf dabei nicht durchstoßen werden

15 7. Gelelektrophorese Spannung: 180 V Modell:
Verschließen der Elektrophorese-kammer: Kathode (-) nahe den Geltaschen Anode (+) gegenüber Spannung: 180 V Modell:

16 8. Färben der DNA Entnahme des Gelschlittens aus der Elektrophoresekammer Gel in Färbeschale überführen und mit 100 ml Färbelösung (50x) für 2 Minuten färben Färbelösung abgießen (kann wieder verwendet werden) Entfärben des Gels durch zweimaliges Wässern in 45 oC warmen Wasser

17 9. Ergebnis der Gelelektrophorese
TO V1 V2 V3 V4 V5 M 9. Ergebnis der Gelelektrophorese Wer ist der Täter ?